Seipin基因缺陷誘發小鼠腎損害*

吳曉月， 王 歡， 劉雪靜， 廖家葳， 張 玲， 劉國慶， 黃 薇

(北京大學醫學部基礎醫學院心血管研究所， 北京 100191)

Seipin基因缺陷或者突變可導致先天性脂肪營養不良(congenital generalized lipodystrophy，CGL)[1]。它是一種常染色體隱性遺傳性疾病，患者主要表現為全身脂肪組織的缺失，伴有肌肉增生、脂肪肝、胰島素抵抗、心肌肥大等癥狀[2-3]。2004年Javor等[4]的研究發現，在25例CGL病人中，88%的病人出現尿蛋白排泄率升高，92%的病人出現肌酐清除率增高。這些病人腎臟病變主要為1型或者2型膜增生性腎小球腎病，也有部分患者表現為硬化性腎小球腎病或糖尿病性腎病。Seipin基因缺陷作為導致CGL疾病家族的一員，研究發現，45例患者中有7名在14～35歲時死亡，其中2例死于腎功能衰竭[5]。為了研究seipin基因缺陷是否能引起腎臟損害及可能機制，本實驗利用我們研究組首次構建的seipin基因敲除(seipin-/-)小鼠，通過對尿白蛋白含量、腎臟功能及腎臟病理改變的研究，明確seipin基因缺陷能否引起腎損害，同時對可能機制進行初步探討。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1動物 6月齡體重22～25 g的雄性seipin-/-小鼠及C57BL/6野生型(wild-type, WT)小鼠(北京大學醫學部實驗動物中心)，隨機分為2組，每組8只。

1.2試劑和儀器 血糖測定試劑盒(中生北控);小鼠adiponectin和leptinELISA試劑盒(Millipore);小鼠insulinELISA試劑盒(上海依科賽生物)；RNA反轉及實時定量PCR試劑盒(Promega);小鼠尿白蛋白(urinaryalbumin,UAlb)ELISA試劑盒(Bethyl);實時定量PCR儀(MIResearch);小鼠代謝籠(Tecniplast);圖像分析軟件(LeicaQWIN)。

2 方法

2.1Seipin-/-小鼠基因型鑒定 小鼠離乳后剪尾消化，進行DNA抽提，然后PCR基因型鑒定，引物序列為：loxP上游引物5’-CTTGTCTCAAAGGGGTCT-3’,下游引物5’-CAACAGAACAGACGCT-3’;PNRI上游引物5’-TCTATGGCTCCTTCTACTACTC-3’,下游引物5’-CGAATGATATGACGACGACT -3’。具體方法參照參考文獻[6]。

2.2實時熒光定量PCR 取C57BL/6小鼠各組織(見圖2)，其中腎臟分離腎皮質、腎髓質提取腎小球[7]。提取各組織總RNA，將其逆轉錄為cDNA后，以GAPDH為內參照，進行實時定量PCR檢測基因表達水平[8]。Seipin上游引物5’-GGCTCCTTCTACTACTCCTACA-3’，下游引物5’-CCGATCACGTCCACTCTT-3’。

2.3腎臟相關指標檢測 代謝籠留取24h尿，測24h尿肌酐和尿白蛋白；動物處死前稱重及檢測脛骨長，取右腎去包膜稱重。腎臟于4% 多聚甲醛中固定，石蠟包埋，3μm切片。每個腎臟連續切片5張，過碘酸雪夫氏(PAS)染色后，隨機選取100個腎小球，采用定量圖像分析軟件，計算腎小球表面積和腎基質表面積[9]。同時過碘酸六胺銀染色(PASM)觀察腎基質沉積，Masson染色觀察腎纖維化情況。

2.4血漿生化指標檢測 實驗動物禁食4 h取血，離心后取血漿-20 ℃保存。血漿葡萄糖、胰島素、脂聯素及瘦素測定方法均按試劑盒說明書操作。葡萄糖耐量實驗時，小鼠禁食4 h，腹腔注射20% 葡萄糖2 g/kg。分別在注射后0、15、30、60和120 min采血進行血糖測定。

3 統計學處理

采用SPSS 17.0軟件處理。數據以均數±標準誤(mean±SEM)表示，數據采用t檢驗統計分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 Seipin-/-小鼠基因鑒定

將卵細胞特異性的Cre轉基因動物與seipin基因第3外顯子兩側帶有loxP位點的動物進行雜交，得到seipin雜合子(seipin+/-)小鼠，純合子是由雜合子互相交配獲得[6]。野生型僅可擴增出1條300 bp 的帶有loxP基因序列的條帶，seipin-/-小鼠則僅能擴增出1條帶有卵細胞Cre啟動子PNRI位點的1 100 bp的條帶,見圖1。

Figure 1. Representation of genotyping results in seipin-/- mice; +/+: wild-type mice；+/-: seipin knockout heterozygote mice; -/-: seipin knockout homozygote mice.

2 WT小鼠各組織及腎臟各部位seipin mRNA的表達水平

Seipin mRNA在6個月C57BL/6小鼠中主要表達在睪丸及脂肪，腎臟中也有表達，但是水平較低，僅為睪丸及脂肪的10%～20%，見圖2A。在腎臟中 seipin mRNA主要表達在腎皮質，表達量約為髓質的4倍，皮質中又主要在腎小球中表達量最高，見圖2B。

Figure 2. Analysis of seipin mRNA expression levels in different tissues (A) and each part of the kidney (B) by qRT-PCR in C57BL/6 mice.WAT: white adipose tissue；BAT: brown adipose tissue; cortical: cortical substance of kidney; medulla: medulla of kidney.Mean±SEM.n=8.

3 Seipin-/-小鼠腎重、尿白蛋白及肌酐清除率檢測

與WT小鼠相比，seipin-/-小鼠腎臟重量顯著增加，但是腎重/體重比沒有明顯差異，這可能和小鼠seipin缺陷后肌肉增生，嚴重脂肪肝導致體重增加有關。因此我們使用腎重/脛骨長來修正動物間的個體差異，發現seipin-/-小鼠腎重/脛骨長明顯高于對照組小鼠(P<0.01)。Seipin-/-小鼠24 h尿微量白蛋白(P<0.01)及肌酐清除率(P<0.01)均較WT小鼠明顯增高，見表1。

表1 Seipin-/-和WT雄性小鼠6個月時體重、腎重、尿白蛋白及肌酐清除率的比較

*P<0.05，**P<0.01 vsWT.

4 Seipin-/-小鼠腎臟病理改變

PASM將富含IV型膠原的腎系膜基質、腎小球基底膜染成黑色。和WT小鼠相比，seipin-/-可見明顯的腎小球系膜區增寬，系膜細胞和系膜基質增生，見圖3A；D。PAS染色將基質染成紅色，定量結果顯示seipin-/-小鼠腎小球表面積明顯增大(P<0.05)，見圖3G；腎小球基質沉積增多(P<0.05)，見圖3H。Masson染色沒有發現seipin-/-小鼠出現明顯的腎纖維化，見圖3C、F。

5 Seipin-/-小鼠糖耐量、血漿胰島素、瘦素和脂聯素水平

Seipin-/-小鼠和WT小鼠相比，空腹血糖增高，糖耐量實驗異常，血漿胰島素含量顯著增加(P<0.01)，提示seipin-/-小鼠有胰島素抵抗。由于脂肪組織的缺失，和對照組小鼠相比，seipin-/-小鼠血漿瘦素(P<0.01)及脂聯素(P<0.05)水平明顯降低，見圖4。

討 論

Seipin是通過定位克隆的方法于2001年由Magre等[1]從 9個先天性全身脂肪營養不良的家系中篩選出來的，是一個2次跨膜蛋白，定位于內質網[10]。目前seipin的研究主要集中在脂肪細胞的分化、脂解及脂滴形成上[11-12]，關于它對腎臟的影響尚不明確。

我們首次發現將小鼠seipin基因敲除后，小鼠出現了明顯的早期腎臟損傷，主要表現為24h尿白蛋白含量及肌酐清除率增高，腎小球肥大及腎小球基質沉積增多。通過檢測seipinmRNA在全身各組織表達，我們發現其在睪丸及脂肪中表達量最高，在腎臟中可檢測到較低水平的seipin表達，主要位于腎小球部位。

Figure 3. Renal morphology and quantitative analysis of glomerular surface area and mesangial surface area in seipin-/- mice (×400). A,D: renal PASM staining;B,E: PAS staining; C,F: Masson staining. A,B,C: WT mice; D,E,F: seipin-/- mice; G: quantification of glomerular surface area; H: mesangial surface area.Mean±SEM.n=8.*P<0.05 vs WT group.

Figure 4. Glucose tolerance (A), plasma insulin (B), leptin (C) and adiponectin (D) levels in seipin-/- and WT mice.Mean±SEM.n=8.*P<0.05,**P<0.01 vs WT group.

Seipin缺失后表現為以脂肪缺失為主的全身代謝障礙[6]，我們在seipin-/-小鼠中發現由脂肪組織分泌的瘦素和脂聯素在血漿中的含量降低，同時存在明顯的胰島素抵抗(圖4)。

瘦素主要由血漿游離型發揮生理功能，參與機體能量代謝，抑制攝食，增加胰島素敏感性。瘦素分泌不足、受體缺陷或瘦素抵抗導致的高瘦素血癥可通過促進胰島素抵抗、激活RAS系統、誘發氧化應激及免疫功能紊亂從而促進腎臟的損傷[13-14]。本實驗發現seipin-/-小鼠有明顯的腎損傷，可能與瘦素水平下降相關。另有研究表明，CGL病人用瘦素治療后，可明顯改善胰島素抵抗及蛋白尿[15]，進一步證實了上述觀點。

脂聯素是脂肪組織分泌最多的因子。它可以通過NF-κB及TNF-α途徑抑制炎癥及保護內皮細胞，起到抗動脈粥樣硬化和增加胰島素敏感性等作用。脂聯素的缺失，可導致小鼠出現尿白蛋白增高和腎臟纖維化等病變，與炎癥及氧化增高相關[16]。本實驗seipin-/-小鼠的腎損害與脂聯素水平下降可能也有一定關系，但目前還沒有用脂聯素治療改善CGL病人腎損傷的報道。

臨床研究發現88%的CGL患者均有早期腎損害的表現[4]，也提示seipin基因缺陷導致的腎損害至少部分可能是由于脂肪組織缺失后，全身代謝障礙引起。

雖然seipin在腎臟中表達水平不高， 但seipin-/-小鼠的腎損傷除了與全身代謝障礙相關外，是否與腎局部seipin表達的缺失相關將是我們下一步要研究的內容。Seipin腎臟特異敲除小鼠將為我們解決這一問題。

綜上所述，本研究首次發現seipin-/-小鼠出現明顯的腎損傷，可能與全身脂肪缺失導致的瘦素和脂聯素水平下降相關。

[參 考 文 獻]

[1]MagreJ,DelepineM,KhalloufE,etal.IdentificationofthegenealteredinBerardinelli-Seipcongenitallipodystrophyonchromosome11q13[J].NatureGenetics， 2001，28(4):365-370.

[2] Simha V, Agarwal AK, Oral EA, et al. Genetic and phenotypic heterogeneity in patients with mandibuloacral dysplasia-associated lipodystrophy[J]. J Clin Endocrinol Metab， 2003，88(6):2821-2824.

[3]AgarwalAK,GargA.Congenitalgeneralizedlipodystrophy:significanceoftriglyceridebiosyntheticpathways[J].TrendsEndocrinolMetab， 2003，14(5):214-221.

[4] Javor ED, Moran SA, Young JR, et al. Proteinuric nephropathy in acquired and congenital generalized lipodystrophy: baseline characteristics and course during recombinant leptin therapy[J]. J Clin Endocrinol Metab, 2004，89(7):3199-3207.

[5]VanMaldergemL,MagreJ,KhalloufTE,etal.Genotype-phenotyperelationshipsinBerardinelli-Seipcongenitallipodystrophy[J].JMedGenet，2002, 39(10):722-733.

[6] Cui X, Wang Y, Tang Y, et al. Seipin ablation in mice results in severe generalized lipodystrophy[J]. Human Mol Genetics, 2011，20(15):3022-3030.

[7]MinoruTakemotoNA,HolgerGerhardtAL.Anewmethodforlargescaleisolationofkidneyglomerulifrommice[J].AmJPathol, 2002，161(3):799-805.

[8] Fink L, Seeger W, Ermert L, et al. Real-time quantitative RT-PCR after laser-assisted cell picking[J]. Nature Med， 1998，4(11):1329-1333.

[9]HuangW,GalloisY,BoubyN，etal.GeneticallyincreasedangiotensinI-convertingenzymelevelandrenalcomplicationsinthediabeticmouse[J].ProcNatlAcadSciUSA，2001，98(23):13330-13334.

[10] Lundin C, Nordstrom R, Wagner K, et al. Membrane topology of the human seipin protein[J]. FEBS Lett， 2006，580(9):2281-2284.

[11]PayneVA,GrimseyN,TuthillA,etal.ThehumanlipodystrophygeneBSCL2/seipinmaybeessentialfornormaladipocytedifferentiation[J].Diabetes，2008，57(8):2055-2060.

[12] Liu L, Jiang Q, Wang X, et al. Adipose-specific knockout of Seipin/Bscl2 results in progressive lipodystrophy[J]. Diabetes， 2014，63(7)：2320-2331.

[13]NasrallahMP,ZiyadehFN.Overviewofthephysiologyandpathophysiologyofleptinwithspecialemphasisonitsroleinthekidney[J].SeminarsNephrol，2013，33(1):54-65.

[14] Procaccini C, Jirillo E, Matarese G. Leptin as an immunomodulator[J]. Mol Aspects Med， 2012，33(1):35-45.

[15]ChongAY,LupsaBC,CochranEK,etal.Efficacyofleptintherapyinthedifferentformsofhumanlipodystrophy[J].Diabetologia， 2010，53(1):27-35.

[16] Rüster C， Wolf G. Adipokines promote chronic kidney disease[J]. Nephrol Dial Transplant， 2013， 28(4): 8-14.