尾加壓素Ⅱ通過ERK1/2途徑誘導大鼠肺動脈平滑肌細胞增殖和上調Egr-1表達*

孟慶紅， 蔡直峰， 趙翠芬△， 李福海， 孔清玉， 夏 偉， 李 棟

(1山東大學齊魯醫(yī)院兒科，山東 濟南 250012； 2濰坊市人民醫(yī)院新生兒科，山東 濰坊 261041；3山東大學齊魯醫(yī)院低溫醫(yī)學研究室，山東 濟南 250012)

肺血管重構是肺動脈高壓發(fā)展為不可逆的標志，隨著肺動脈壓力的升高，患者逐漸發(fā)生難以糾正的右心衰竭和肺血管病變，甚至導致死亡[1]。肺血管重構以肺動脈平滑肌細胞增殖和遷移為核心環(huán)節(jié)，最終導致肺血管狹窄和閉塞[2]。尾加壓素Ⅱ(urotensin Ⅱ，UⅡ)是近年發(fā)現(xiàn)的具有強效血管收縮效應的生長抑素樣環(huán)肽[3]。體內一種孤立的G蛋白偶聯(lián)受體GPR14是UⅡ的特異性受體，后來被命名為UT[4]。UⅡ及其受體UT在心血管系統(tǒng)中廣泛分布，參與多種心血管疾病包括肺動脈高壓和肺血管重構的發(fā)病過程[5]。Urantide是迄今發(fā)現(xiàn)的最為強效的UⅡ受體拮抗劑，能夠有效抑制UⅡ的促主動脈平滑肌細胞增殖作用[6]。早期生長反應因子1(early growth response factor-1, Egr-1)是參與肺動脈高壓形成的重要調節(jié)因子[7-8]。研究證實Egr-1參與慢性缺氧性肺血管重構過程[9]。高血流性肺動脈高壓大鼠肺血管組織中Egr-1 mRNA 表達明顯增加[10]。據(jù)此我們推測UⅡ與Egr-1之間存在著一定的聯(lián)系。本研究探討UⅡ誘導的培養(yǎng)大鼠肺動脈平滑肌細胞(pulmonary arterial smooth muscle cells,PASMCs)增殖的信號轉導機制，并探討Egr-1是否參與了UⅡ誘導的PASMCs增殖過程。

材 料 和 方 法

1 動物

100～150 g健康雄性Wistar大鼠(購自山東大學醫(yī)學院實驗動物中心)。

2 主要試劑

UⅡ、urantide和PD98059(Sigma)；RPMI-1640(HyClone)；兔抗α-actin單克隆抗體、辣根酶標記山羊抗兔IgG、兔抗GAPDH 單克隆抗體(Sigma)；FITC標記山羊抗兔IgG(中杉金橋)；兔抗磷酸化細胞外信號調節(jié)激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2, ERK1/2 )、應激活化蛋白激酶(stress-activated protein kinase, SAPK)、p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase, p38 MAPK)多克隆抗體(Biosysthesis)；兔抗Egr-1多克隆抗體(Sigma)；Trizol提取液、PCR引物及實時熒光定量PCR試劑盒(TaKaRa)；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(杭州碧云天公司)；HRP顯色試劑(Millipore)。實驗用儀器、設備及其它試劑均有山東大學齊魯醫(yī)院低溫醫(yī)學研究室提供。

3 主要方法

3.1大鼠PASMCs的培養(yǎng)及免疫熒光鑒定 取100～150 g Wistar大鼠，2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉處死后，迅速于無菌條件下取心肺組織。顯微器械小心分離出肺動脈血管壁中膜并剪成約1 mm×1 mm×1 mm大小碎塊，置于25 cm2培養(yǎng)瓶內，倒置放于培養(yǎng)箱內，待組織塊干涸(約1～1.5 h)，加入含15%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。當原代細胞融合至80%后即傳代。經形態(tài)學及兔抗α-肌動蛋白(α-actin)抗體免疫熒光檢測證實為平滑肌細胞，且細胞純度達89%以上。實驗采用3～6代細胞。

3.2BrdU摻入實驗 取3～6代細胞，酸處理蓋玻片放入6孔板內做細胞爬片，分為(1 μmol/L、0.1 μmol/L 和0.01 μmol/L)UⅡ組、1 μmol/L UⅡ+1 μmol/L urantide組和不給予刺激組，分別作用24 h，固定前3 h摻入BrdU，終濃度為30 μg/L,每組做2張爬片，兔抗BrdU 4 ℃過夜，F(xiàn)ITC標記山羊抗兔IgG (1∶100)孵育30 min，DAPI染核，封片。每張爬片在熒光顯微鏡下(×400)隨機取5個視野，計數(shù)視野中細胞總數(shù)及BrdU陽性細胞數(shù)目，計算標記指數(shù)(labeling index)=BrdU陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù)。

3.3Real-time PCR 各組細胞經處理，作用24 h后參照Trizol試劑盒使用說明提取總RNA，去除基因組DNA,參照TaKaRa公司的逆轉錄試劑盒說明書將總RNA逆轉錄為cDNA。按照Albertin real-time PCR方法將cDNA置于ABI 7500 real-time PCR反應系統(tǒng)中進行PCR反應。以GAPDH為內參照，計算ERK1/2、SAPK、p38 MAPK及Egr-1 mRNA表達量。ERK1/2上游引物: 5′-CCCAGGGGAACTGCTGGG-3′ (18 bp),下游引物: 5′-GTCAAGAGCTTTGGAGTC-3′ (18 bp); SAPK上游引物: 5′-ATGAGCCTCATTCGGAAA-3′ (18 bp), 下游引物: 5′-TTCACGGCCAGGTTGCCT-3′ (18 bp); p38 MAPK上游引物: 5′-AACAAGACCGTCTGGGAGGTGC-3′ (22 bp), 下游引物: 5′-TTGGCGTGAATGATGGACTGAAA-3 ′(23 bp); Egr-1上游引物: 5′-ACGGGGCTCCCCAGTTTCCTC-3′ (21 bp), 下游引物: 5′-GGGTTGTTCGCTCGGCTCCC-3′(20 bp); GAPDH上游引物: 5′-GCTCTCTGCTCCTC CCTGTTCT-3′ (22 bp), 下游引物: 5′-CAGGCGTCCGATACGGCCAAA-3′ (21 bp)。

3.4Western blotting分析 各組細胞經處理，作用24 h后檢測磷酸化ERK1/2 (p-ERK1/2)、p-SAPK和p-p38 MAPK蛋白表達，常規(guī)裂解細胞提取細胞總蛋白，加入上樣緩沖液后煮沸5～10 min使蛋白變性，經SDS-PAGE分離，再電轉至PVDF膜，封閉后分別加入兔抗GAPDH(1∶200)、p-ERK1/2(1∶200)、p-SAPK(1∶300)、p-P38MAPK(1∶300)和Egr-1(1∶500)多克隆抗體, 4 ℃搖床孵育過夜，與辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(1∶10 000)室溫孵育1 h，再與電致化學發(fā)光液ECL溫育1 min后曝光，顯影和定影。最后對結果進行吸光度掃描分析。

4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析,實驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 培養(yǎng)大鼠PASMCs鑒定

培養(yǎng)3～5 d，原代PASMCs在倒置相差顯微鏡下可以看到有的組織塊周圍出現(xiàn)以“鋪路石”樣形狀的細胞爬出，逐漸長出長梭形細胞，2周左右長滿瓶底的80%左右，傳代至3代以后的細胞生長到一定密度后可見典型的“峰-谷”樣生長方式。用兔抗血管平滑肌細胞單克隆抗體(α-actin抗體)及FITC標記山羊抗兔抗體鑒定為平滑肌細胞，見圖1。

Figure 1. Identification of rat PASMCs by immunofluorescence(×200).

2 UⅡ對培養(yǎng)大鼠PASMCs 增殖的影響

BrdU摻入實驗結果顯示UⅡ(1 μmol/L、0.1 μmol/L和0.01 μmol/L)呈濃度依賴性地促進PASMCs增殖(P<0.05或P<0.01)；urantide可抑制UⅡ促PASMCs增殖作用(P<0.05)，見圖2。這提示UⅡ通過與特異性受體UT結合刺激PASMCs增殖。

3 不同濃度UⅡ、urantide及PD98059對大鼠PASMCs ERK1/2、SAPK、p38 MAPK和Egr-1 mRNA表達的影響

Real-time PCR結果顯示：UⅡ(1 μmol/L、0.1 μmol/L和0.01 μmol/L)呈濃度依賴性地上調ERK1/2、SAPK和Egr-1 mRNA表達(P<0.01或P<0.05)，p38 MAPK mRNA表達無明顯變化；urantide和PD98059均可拮抗UⅡ上調ERK1/2、SAPK及Egr-1 mRNA表達的作用(P<0.01或P<0.05)，見圖3。

Figure 2. Effect of different concentrations of UⅡand urantide on the proliferation of cultured PASMCs detected by BrdU incorporation.U1: 1 μmol/L UII; U2: 0.1 μmol/L UII; U3: 0.01 μmol/L UII; U+UR: 1 μmol/L UII+1 μmol/L urantide. Mean±SD. n=6. *P<0.05, **P<0.01 vs control； #P<0.05 vs U1.

Figure 3. Effect of different concentrations of UⅡand urantide on the expression of ERK1/2, SAPK, p38 MAPK and Egr-1 mRNA in cultured PASMCs detected by real-time PCR.U1: 1 μmol/L UII; U2: 0.1 μmol/L UII; U3: 0.01 μmol/L UII; U+UR: 1 μmol/L UII+1 μmol/L urantide; U+PD: 1 μmol/L UII+10 μmol/L PD98059. Mean±SD. n=6. *P<0.05, **P<0.01 vs control； #P<0.05, ##P<0.01 vs U1.

4 不同濃度UⅡ及urantide及PD98059對大鼠PASMCs p-ERK1/2、p-SAPK、p-p38 MAPK和Egr-1蛋白表達的影響

Western blotting分析顯示：UⅡ (0.01、0.1和1 μmol/L)呈濃度依賴性地增加p-ERK1/2、p-SAPK和Egr-1蛋白表達(P<0.05)，p-p38 MAPK蛋白表達無明顯變化；urantide和PD98059可拮抗UⅡ上調p-ERK1/2、p-SAPK及Egr-1表達的作用，見圖4。

Figure 4. Effect of different concentrations of UⅡand urantide on the protein expression of p-ERK1/2, p-SAPK, p-p38 MAPK and Egr-1 in PASMCs detected by Wes-tern blotting. U1: 1 μmol/L UII; U2: 0.1 μmol/L UII; U3: 0.01 μmol/L UII; U+UR: 1 μmol/L UII+1 μmol/L urantide; U+PD: 1 μmol/L UII+10 μmol/L PD98059. Mean±SD. n=6.*P<0.05, **P<0.01 vs control； #P<0.05, ##P<0.01 vs U1.

討 論

本研究發(fā)現(xiàn)UⅡ濃度依賴性地促進肺動脈平滑肌細胞增殖，UⅡ受體拮抗劑urantide可拮抗UⅡ的促PASMCs增殖作用。推測不同濃度UⅡ首先與其特異性受體結合，促使PASMCs增殖。血管平滑肌細胞是血管中膜的主要組成成分,在炎癥及機械損傷的作用下,血管平滑肌細胞由正常的收縮表型向分泌型轉化,促使血管平滑肌細胞分泌多種血管活性肽，導致多種心血管疾病的發(fā)生。UⅡ是近年來發(fā)現(xiàn)的重要的心血管調節(jié)活性肽，UⅡ及其特異性受體UT發(fā)生特異性結合后，可發(fā)揮廣泛的生物學作用，如收縮血管使血壓升高、促進細胞增殖及一些內分泌效應等[11]。研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠肺動脈高壓病理模型中,肺中、小動脈UⅡ蛋白及其受體UT表達增加[12], 提示UⅡ參與肺動脈高壓和肺血管重構的形成。

本研究還發(fā)現(xiàn)UⅡ可濃度依賴性地上調絲裂原活化蛋白激酶家族中ERK1/2、SAPK和Egr-1的基因及蛋白表達，同時ERK1/2選擇性抑制劑PD98059和UⅡ特異性受體拮抗劑Urantide可拮抗UⅡ的上調作用，而p38 MAPK mRNA及蛋白表達不被PD98059和urantide所拮抗。推測UⅡ通過激活ERK1/2和Egr-1 mRNA及蛋白表達，促使PASMCs有絲分裂增加，導致肺動脈平滑肌細胞增殖，urantide通過受體途徑拮抗UⅡ的促增殖作用。 但在UⅡ誘導細胞增殖過程中，ERK1/2和SAPK作用的重要性及兩者之間的關系如何，本實驗未進行相關研究。

絲裂原活化蛋白激酶通路為多種細胞外信號從細胞表面受體傳向細胞內的重要信號轉導通路。已被完全證實的傳導通路有3條: ERK1/2、SAPK和p38 MAPK。ERK1/2和SAPK均與細胞增殖與分化反應有關，分別通過激活受體酪氨酸激酶和G蛋白途徑，相繼MAPK激酶激活，后者激活轉錄因子、刺激與細胞增殖有關的基因轉錄，促進細胞的生長、分化與增殖[13]。研究已證實MAPK在VSMCs增殖、分化、凋亡、細胞骨架等重構及細胞周期中起著非常重要的作用[14]。本研究結果顯示ERK1/2及SAPK信號通路在尾加壓素Ⅱ誘導PASMCs增殖中均被激活。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)UⅡ濃度依賴性地促進Egr-1 mRNA的表達，同時其促進作用可被PD98059和urantide拮抗，證實Egr-1參與了尾加壓素Ⅱ誘導EEK1/2表達，但Egr-1在三者間發(fā)揮作用的具體機制尚不明確，這也是本課題下一步的研究目標。目前已明確鋅指轉錄因子Egr-1參與多種細胞可誘導基因的表達，慢性缺氧小鼠肺血管組織中Egr-1表達增加，并具有缺氧時間和氧氣濃度依賴性[15]。肺血管系統(tǒng)中有2種基因受Egr-1調控：組織因子和ERK1/2，同時ERK1/2可反向誘導Egr-1的表達[16]。研究發(fā)現(xiàn)，慢性缺氧性肺動脈高壓小牛，肺組織活性氧產生增加，從而導致Egr-1 mRNA表達增加，后者通過誘導ERK1/2通路而最終導致小牛肺血管重構[17]。

綜上所述，一定濃度范圍內的UⅡ通過與其特異性受體UT結合，激活ERK1/2信號途徑，進一步誘導Egr-1表達，導致肺動脈平滑肌細胞增殖。

[參 考 文 獻]

[1] Rabinovitch M.Molecular pathogenesis of pulmonary arterial hypertension[J]. Clin Invest, 2008, 118(7):2372-2379.

[2] Saji T. Update on pediatric pulmonary arterial hypertension[J]. Circ, 2013, 77(11): 2639-2650.

[3] Dai HY, He T, Li XL, et al. Urotensin-2 promotes collagen synthesis via ERK1/2-dependent and ERK1/2-independent TGF-β1in neonatal cardiac fibroblasts[J]. Cell Biol Int, 2011, 35(2): 93-98.

[4] Liu Q, Pong SS, Zeng Z, et al. Identification of urotensin Ⅱ as the endogenous ligand for the orphan G-protein-coupled receptor GPR14[J]. Biochem Biophys Res Commun, 1999, 266(1):174-178.

[5] Watanabe T, Arita S, Shiraishi Y, et al . Human urotensin Ⅱ promotes hypertension and atherosclerotic cardiovascular diseases[J]. Curr Med Chem, 2009, 16(5):550-563.

[6] McDonald J, Batuwangala M, Lambert DG. Role of urotensin Ⅱ and its receptor in health and disease[J].J Anesth, 2007, 21(3):378-379.

[7] Pagel JI, Deindl E. Disease progression mediated by Egr-1 associated signaling in response to oxidative stress[J]. Int J Mol Sci, 2012, 13(10):13104-13117.

[8] Pagel JI, Ziegelhoeffer T, Heil M,et al. Role of early growth response 1 in arteriogenesis: impact on vascular cell proliferation and leukocyte recruitmentinvivo[J]. Thromb Haemost, 2012, 107(3):562-574.

[9] Nozik-Grayck E, Suliman HB, Majka S, et al. Lung EC-SOD overexpression attenuates hypoxic induction of Egr-1 and chronic hypoxic pulmonary vascular remodeling[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2008, 295(3):L422-L430.

[10]Dickinson MG, Bartelds B, Molema G, et al. Egr-1 expression during neointimal development in flow-associated pulmonary hypertension[J]. Am J Pathol, 2011, 179(5):2199-2209.

[11]Albertin G, Guidolin D, Sorato E, et al. Urotensin-Ⅱ-stimulated expression of pro-angiogenic factors in human vascular endothelial cells[J]. Regul Pept, 2011, 172(1-3):16-22.

[12]彭公永, 何志義, 劉啟才, 等. 尾加壓素Ⅱ促兔肺動脈平滑肌細胞增殖及機理探討[J]. 中國病理生理雜志, 2004, 20(9):1597-1600.

[13]Chen CA, Chen TS, Chen HC. Extracellular signal-regulated kinase plays a proapoptotic role in podocytes after reactive oxygen species treatment and inhibition of integrin-extracellular matrix interaction[J]. Exp Biol Med, 2012, 237(7):777-783.

[14]Jiang J, Wang S, Wang Z, et al. The role of ERK1/2 in 15-HETE-inhibited apoptosis in pulmonary arterial smooth muscle cells[J]. Recept Signal Transduct Res, 2011，31(5):45-52.

[15]Zhang J, Guo C, Wang R, et al. An Egr-1-specific DNAzyme regulates Egr-1 and proliferating cell nuclear antigen expression in rat vascular smooth muscle cells[J]. Exp Ther Med, 2013, 5(5):1371-1374.

[16]Aggeli IK, Beis I, Gaitanaki C. ERKs and JNKs mediate hydrogen peroxide-induced Egr-1 expression and nuclear accumulation in H9c2 cells[J]. Physiol Res, 2009, 59(3):443-454.

[17]Hartney T, Birari R, Venkataraman S, et al. Xanthine oxidase-derived ROS upregulate Egr-1 via ERK1/2 in pulmonary arterial smooth muscle cells; model to test impact of extracellular ROS in chronic hypoxia[J]. PLoS One, 2011, 6(11):e27531.