金屬硫蛋白與線粒體功能調節*

黃 昌, 郭家彬, 馮 敏, 彭雙清△

(1廣西醫科大學研究生學院，廣西 南寧 530021； 2軍事醫學科學院疾病預防控制所毒理學評價研究中心，北京 100071)

金屬硫蛋白(metallothioneins, MTs)是一類富含半胱氨酸殘基并與金屬離子結合的小分子蛋白，廣泛分布于細菌、植物、無脊椎動物和脊椎動物體內[1]，由于疏基和金屬含量極高加上結構特殊，因此被稱為金屬硫蛋白。MTs廣泛參與細胞生命活動的調節過程，其生物學功能主要有維持金屬離子內穩態、解毒重金屬、清除氧自由基、抑制炎癥因子等[2]。近年來，越來越多的證據顯示MTs在抗氧化損傷和抑制細胞凋亡方面具有顯著作用，特別是MTs參與線粒體功能的調節及具體作用機制倍受關注，認為MTs具有維持線粒體功能和促進線粒體損傷修復作用。由于線粒體功能結構極其復雜，其具體的調節機制仍不清楚。據目前的研究結果顯示MTs可能參與線粒體的呼吸鏈、能量代謝、線粒體酶活性、金屬內穩態、細胞凋亡信號通路和線粒體生成等生理過程的調節。本文將重點對MTs的生物學功及其對線粒體功能調節的影響進行綜述，闡明MTs與線粒體生理功能的關系及其可能的作用機制。

1 金屬硫蛋白的生物學特征

自1957年發現MTs作為一類金屬結合蛋白以來其功能特征包括物理、化學和生物學性能均得到廣泛研究。哺乳類動物體內MTs包含有61～68個氨基酸，其中20個為半胱氨酸。MTs可分為4個亞型MT(I～IV)，各亞型的差異主要體現在翻譯后蛋白一級結構的修飾上，表現為金屬離子整合和降解速度的不同。盡管各亞型的物理化學性質相似，但是在機體的表達分布及生物學功能卻有很大的差別。MT-I和MT-II幾乎同時出現在所有的軟組織中，是MTs的主要異構形式；MT-III主要在大腦組織表達，在心臟，腎臟和生殖器官也有少量表達，與MT-I/II最大區別是抑制神經生長因子的作用；MT-IV主要是在口腔上皮、食管、胃上部、尾巴、腳底和新生兒皮膚的復層鱗狀上皮細胞中發現的。MTs在細胞中的表達主要是通過金屬離子順式應答元件和氧化應激反應元件對MTs的啟動子近端進行調節[3]。在正常生理狀態下，MTs在細胞中的表達水平比較低，生物學功能并未發揮顯著的作用。在藥物毒性、氧化物質或金屬離子等各種應激因子的誘導下MT的表達可以在1 h內迅速上調并持續到應激后24 h，發揮細胞保護作用[4-7]。

2 線粒體功能

線粒體是真核生物細胞內普遍存在的一種重要細胞器，是細胞有氧呼吸和供能的主要場所，通過線粒體的氧化磷酸化可以為細胞生命活動提供95%的能量。線粒體是細胞內除了細胞核外唯一具有遺傳功能的細胞器，含有幾個自身遺傳環狀mtDNA，具有半保留自主復制、轉錄和翻譯的功能。線粒體在氨基酸合成、脂質代謝、亞鐵紅素合成、金屬離子代謝、鈣通路、細胞信號調控和細胞凋亡等方面起著重要作用[11]。線粒體功能紊亂將導致退行性和老化性疾病發生。已有大量文獻說明許多疾病與線粒體功能障礙相關，包括心血管疾病、神經退行性疾病如阿爾茨海默病、帕金森病、糖尿病、癌癥、老年病和免疫缺陷綜合癥等。

在線粒體基質內，通過三羧酸循環酶系將底物脫氫氧化生成NADH，NADH通過線粒體內膜呼吸鏈氧化成NAD，與此同時，導致跨膜質子移位形成跨膜質子梯度和跨膜電位。在病理、化學物質應激下，線粒體酶和蛋白的功能受損，導致多種電子傳遞鏈的復合物(I～IV)和載體(泛醌、細胞色素C)的電子傳遞功能失效，大量的電子泄漏并與氧分子結合生成超氧陰離子，在超氧歧化酶作用下快速轉化成過氧化氫，氧自由基迅速增多導致線粒體膜的功能結構破壞和mtDNA突變率增加，引起氧化磷酸化功能和電子傳遞鏈酶活性進一步降低，形成惡性循環，最終導致線粒體功能紊亂[12-13]。

人體內每天大量的物質通過線粒體內膜，在線粒體膜與細胞質和細胞器之間的物質交換需要大量的載體、轉運蛋白和細胞通道來完成。線粒體膜的運輸通道蛋白大部分是由核編碼的蛋白，這些蛋白是如何進入線粒體，又是如何相互協調完成物質的運輸的具體機制目前尚不完全清楚。為了更好地獲得線粒體蛋白功能網，弄清整套線粒體蛋白組的調節系統已成為研究重點。在近年來，隨著生物學技術的發展，在線粒體功能紊亂時，發現并已經確定有許多蛋白的表達發生變化，包括MTs。相關研究顯示MTs可以降低線粒體功能紊亂，減輕線粒體損傷，其作用機制可能與MTs抗氧化損傷、抑制凋亡及金屬離子調節的功能有關。

3 MTs對線粒體功能的影響

3.1MTs與線粒體活性氧(reactive oxygen species,ROS)生成 采用無細胞體系的研究發現MT-I作為ROS清除劑能有效抑制ROS引起的細胞毒性，MT-I+II表達缺失小鼠對阿霉素(doxorubicin，DOX)誘導的心肌細胞線粒體膜電位降低和ROS增多更敏感[14]，說明MTs具有清除ROS、減輕細胞損傷的作用。MTs作為一種有效的自由基清除劑，具有很強的抗氧化活性，能及時清除體內因各種原因引起的自由基堆積，對維持機體的氧化還原平衡發揮重要作用。線粒體是ROS的生產中心，正常生理條件下機體內ROS的生成與清除處于平衡狀態。當線粒體受到應激時將產生大量的ROS，導致線粒體功能紊亂及氧化還原反應嚴重失衡。雖然MTs在線粒體中不表達，但在線粒體膜間隙中卻有大量分布，可以有效清除擴散到線粒體膜間隙的ROS，防止ROS向細胞基質中擴散，對抑制線粒體內膜蛋白及其它細胞器的氧化損傷起到重要作用[15]。

通過采用魚藤酮抑制線粒體復合物I活性誘導HeLa細胞內ROS生成增多的研究發現，MT-IIA過表達的HeLa細胞存活率明顯高于野生型[7]，提示MTs除了清除ROS，還可能具有升高復合物I活性，抑制ROS生成的作用。有研究報道MTs在氧化應激時可以通過改變核編碼的復合物IV亞基的修飾，增強復合物IV對氧的利用率[15]。因此，MTs可以通過對線粒體復合物活性和基因表達的調節，增強線粒體呼吸鏈對氧的利用率，抑制線粒體ROS的生成。

3.2MTs參與調節線粒體依賴的細胞凋亡 細胞凋亡是由多基因控制的有序性細胞自主死亡，是多細胞生物體發育和生存的自然生理現象。在線粒體功能紊亂和氧化應激狀態下，產生大量的細胞凋亡啟動劑如ROS、白細胞介素、腫瘤壞死因子α等，使細胞凋亡數量顯著增多。近年來研究顯示MTs具有抑制細胞凋亡的作用，如Cai等[16]研究發現在氧化應激作用下MT表達缺失小鼠的細胞凋亡率明顯高于正常細胞。其可能的作用機制與MTs抗氧化能力和抑制炎癥反應有密切關系。凋亡作為關鍵的細胞生理過程，其本身具有完善的調節系統，涉及到多種基因和蛋白的調控，如Bcl-2家族、caspase家族、癌基因如c-myc、抑癌基因p53等。MTs可以直接或間接調控細胞凋亡級聯系統，參與線粒體細胞凋亡通路的調節。研究顯示在細胞凋亡前期MTs可以減少線粒體細胞色素C釋放和抑制caspase-3活性，認為主要是由Zn2+與MTs共同對caspase-3活性進行調節[17]。此外，研究報道MTs抑制細胞凋亡的過程與核轉錄因子κB(NF-κB)、腫瘤抑制蛋白(P53)、Bax和Bcl-2的調節有關。在氧化應激下MTs可以抑制P38 MAPK、Bax和P53蛋白表達，促進Bcl-2表達和NF-κB活性，但是MTs對這些細胞因子的具體作用機制尚不清楚[18]。

3.3MTs對金屬離子和線粒體酶的調節作用 Zn2+和Cu2+是細胞內多種酶類和轉錄因子的必須金屬離子，對細胞生命過程及信號通路的調節具有重要意義[19]。研究表明通過調節Zn2+含量可以抑制復合物III活性和細胞色素C釋放[20]。MTs具有高熱穩定性，是Zn2+等金屬離子的高效螯合劑，對體內Zn2+具有明顯調節作用。MTs通過將Zn2+和Cu2+等金屬離子轉運給酶類、抗氧化因子和轉錄因子等參與細胞內酶活性的調節。MTs對線粒體酶活性的調節與Zn2+有關，主要是通過轉運Zn2+作用激活線粒體酶活性。研究發現從MT-/-小鼠心肌細胞提取的順烏頭酸酶無法與ZnCl2的Zn2+結合，但卻能夠與MT-II上結合的Zn2+發生作用[21]，提示Zn2+可能是通過MTs介導與線粒體順烏頭酸酶發生作用。其機制可能是Zn2+與低分子量的鋅離子配體如Zn7MT結合后，在氧化應激或pH降低時，鋅離子配體通過線粒體內膜的鈣單向轉運體轉運到線粒體內與順烏頭酸酶結合[16, 22]。研究報道山梨糖醇脫氫酶使細胞質合成并轉移到線粒體內，當其進入線粒體內時構型發生改變和輔助因子丟失，而MT-I/II可以傳遞Zn2+給山梨糖醇脫氫酶使其恢復活性[23]。因此，MTs雖然不能跨過線粒體內膜，但MTs可以通過轉運金屬離子的方式，向線粒體復合物I～V、細胞色素C氧化酶、超氧化物歧化酶、賴氨酰氧化酶和多巴胺β羥化酶等酶類提供和運送必需金屬，間接參與線粒體酶活性的調節[24]。

在氧化應激作用下輔酶Q被氧化成泛半醌自由基，成為電子泄漏的主要位點。Ebadi等[25]研究顯示MTs可以誘導輔酶Q表達，增強神經元線粒體的功能。其可能機制是MTs通過與Zn2+結合降低Zn2+的濃度，從而激活硫辛酰胺脫氫酶促進輔酶Q的合成[26]。因此，MTs的表達增高可以促進輔酶Q的合成，提高線粒體對氧的利用率，降低自由基產生，對細胞器和細胞結構的氧化應激損傷起到保護作用。

3.4MTs與谷胱甘肽循環 在正常生理條件下，機體內的還原型谷胱甘肽(GSH)水平相對穩定，是機體內清除ROS的主要物質之一，對維持機體氧化還原平衡具有重要作用。在氧化應激時GSH嚴重耗竭，機體抗氧化劑嚴重不足，急需其它抗氧化劑的補充。此時，MTs可以在氧化應激誘導下迅速表達上調成為機體主要的抗氧化劑，及時補充機體的抗氧化物，降低細胞內GSH的消耗，維持氧化還原平衡[16]。由于自由基的活性高且半衰期短，要求抗氧化物非常接近自由基產生的部位才能及時有效地將其清除。在缺乏MTs表達的線粒體基質中，MTs無法直接清除線粒體內的ROS，而是通過MTs-谷胱甘肽循環進行清除。研究發現，MTs的β區域可以與谷胱甘肽結合，通過金屬離子的交換促進氧化型谷胱甘肽(GSSG)還原成GSH。因此MTs可以通過調節GSH/GSSG循環，提高線粒體抗氧化劑的含量，間接發揮保護線粒體氧化損傷的作用。MTs與GSSG結合后其結構發生變化，MTs將Zn2+與GSSG Cu2+交換，同時MT-半胱氨酸殘基將GSSG還原成GSH，GSH被轉運到線粒體內與自由基發生氧化反應并釋放Zn2+[27]。由于Zn2+是線粒體酶活性的必需金屬離子，因此，MTs-谷胱甘肽循環對抑制線粒體氧化損傷、調節線粒體酶活性具有重要意義。

3.5MTs對線粒體能量代謝的影響 近年來研究提示，MTs可能在線粒體的能量代謝過程中發揮重要作用。Coyle等[28]報道MT-/-小鼠肝內ATP的水平明顯降低。MT-/-小鼠具有肥胖和生長過速的趨勢，可能是MT-/-小鼠代謝率降低所致[29]。進一步對MT-/-小鼠進行生理生化檢測發現，肥胖基因表達、瘦素及肝臟的脂肪和脂質含量均明顯增高，Cu2+含量明顯降低，葡萄糖、三酰甘油和胰島素的水平沒有明顯變化[29]。盡管MT-/-小鼠的肝臟Zn2+水平沒有明顯改變，但Rofe等[30]用內毒素干預后MT-/-小鼠的肝和血液乳酸鹽的濃度明顯低于野生型小鼠，提示MTs表達缺失可以影響小鼠的能量代謝，但其具體作用機制還不清楚。研究顯示Zn2+和Cu2+對機體的新陳代謝具有調節作用，因此MTs是否通過對Zn2+和Cu2+的調節參與線粒體的能量代謝尚不清楚，還有待進一步研究。研究發現MTs對羅哌卡因引起的心肌細胞ATP功能障礙具有緩解作用[31]。

3.6MTs對線粒體其它功能的影響 研究顯示MTs參與線粒體和細胞質之間的線粒體膜通透性轉換孔的調節，主要是涉及氧化磷酸化和分子代謝轉運[32]。MT-I作用于分離的大鼠肝細胞線粒體轉換孔張開，導致通透性增加、內膜去極化和線粒體膨脹[33]。單獨采用Zn2+處理分離的大鼠肝細胞線粒體可以使轉換孔打開，但是心肌細胞線粒體中卻未產生變化[34]，其可能原因是在心肌細胞線粒體中無MTs介導Zn2+參與線粒體膜通透性轉換孔的調節。MTs除了與金屬離子結合外，還可以與磷酸鹽形成穩定的晶體結構。Maret等[35]發現在體外MTs可以與嘌呤核苷酸磷酸鹽結合，如GTP和ATP，但MTs與ATP結合的親和力相對于其它受體來說是非常低的。還有研究提示MTs對mtDNA的表達和線粒體生成功能也可能具有一定的調節作用，但是目前關于MTs對線粒體mtDNA復制和轉錄調節的報道相對較少，主要認為MTs通過抗氧化應激作用抑制DNA毒性和保護mtDNA的完整性[25, 36-37]。應用心肌MTs特異性高表達小鼠研究表明，MTs可顯著抑制高脂引起的心肌線粒體生成改變，進而抑制心肌功能紊亂和組織氧化損傷[16]。

4 MTs調節線粒體功能的可能作用機制

MTs通過多種途徑參與線粒體病理生理過的調節，對線粒體功能紊亂具有明顯的保護作用。其保護作用機制主要涉及到線粒體的氧化還原、呼吸鏈的電子傳遞、凋亡信號、酶活性、金屬離子、膜轉換孔、線粒體DNA及線粒體生成等功能的調節[27]。目前的研究結果顯示MTs可能主要通過以下途徑發揮對線粒體功能的保護作用：(1)金屬硫蛋白作為一種抗氧化蛋白，具有較強的抗氧化能力，通過清除線粒體ROS，維持線粒體代謝過程中氧化還原平衡，抑制線粒體和mtDNA氧化損傷和細胞凋亡;(2)MTs富含鋅離子且具有較高的親和力，通過MTs-谷胱甘肽的還原反應和金屬離子循環轉運的作用，調節線粒體酶的活性；(3)對線粒體呼吸鏈復合物的調節，增強復合物I和IV對氧的利用率，抑制ROS的生成;(4)MTs對線粒體膜通透性轉換孔的調節，介導Zn2+進入線粒體激活順烏頭酸酶，順烏頭酸酶進一步催化檸檬酸酶轉化為異檸檬酸酶，促進三羧酸循環；(5)MT對線粒體生成功能的調節作用。MTs表達增高可以激活過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激因子-1α(PGC-1α)表達及功能的活化，而PGC-1α是線粒體生成的關鍵調控因子，具有促進線粒體生成的作用。Dong等[38]研究發現MTs具有抗高脂飲食導致的心功能障礙作用，其主要機制可能與MTs調節PGC-1α及下游的調控因子NRF-1/2和mtTFA表達，促進線粒體生成有關。這些研究提示，MT有可能通過多種機制影響線粒體功能。

5 展望

金屬硫蛋白作為多功能應激蛋白，其清除自由基、重金屬解毒和維持金屬離子內穩態等生物學功能已經得到廣泛認同。盡管MTs的物理、化學及遺傳特性已經比較清楚，但其確切的生理功能仍有待于進一步研究。隨著研究的深入，越來越多的研究顯示金屬硫蛋白可通過多種途徑參與線粒體功能的調節，對減輕線粒體損傷和促進線粒體損傷修復具有重要作用。但目前關于MTs與線粒體功能的關系研究報道仍比較少，其具體的作用機制尚不清楚，還有待進一步研究。深入了解MTs對線粒體功能的影響及其機制，對于相關線粒體疾病的預防和治療將具有重要的意義。

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