苯海拉明軟膏微生物限度檢查方法的驗(yàn)證

余曉霞 朱樺 區(qū)杰彬

苯海拉明軟膏為中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院的外用制劑,其主要成分為鹽酸苯海拉明和黃凡士林,具有抗過(guò)敏、止癢、消炎、消腫作用。2013年廣東省食品藥品監(jiān)督管理局對(duì)醫(yī)院制劑提出了標(biāo)準(zhǔn)提高的要求。現(xiàn)根據(jù)《中國(guó)藥典》2010年版[1],對(duì)苯海拉明軟膏微生物限度檢查方法進(jìn)行驗(yàn)證,以保證測(cè)定結(jié)果的可靠性。

1 儀器與材料

1.1 儀器 HTY-2000B集菌儀(杭州泰林醫(yī)療器械廠)、NS01-75D1薄膜過(guò)濾器(北京牛牛基因技術(shù)有限公司,批號(hào)20121223)、超凈工作臺(tái)(蘇凈集團(tuán)安泰公司)、303A-1生化培養(yǎng)箱(上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司)、SPX-100B生化培養(yǎng)箱(上海悅豐儀器表有限公司)。

1.2 試藥 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)：121220),玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)：130108),營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(批號(hào)：121214),改良馬丁培養(yǎng)基(批號(hào)：130109),改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)：130109),膽鹽乳糖培養(yǎng)基(批號(hào)：120309),溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)：130215),甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)：130520)(以上均來(lái)源于北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司)。苯海拉明軟膏(中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院,批號(hào)：201309118,201301111,201401118；規(guī)格：30 g)。

1.3 菌種 大腸埃希菌(Escherichia coli) [CMCC(B)44 102],金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26 003],枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) [CMCC(B)63 501],白色念珠菌(Candida albicans) [CMCC(F)98 001],黑曲霉(Aspergillus niger) [CMCC(F)98 003],銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)[CMCC(B)10 104](以上菌種的凍干菌均購(gòu)自中國(guó)食品藥品生物檢定研究院)。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液制備

2.1.1 大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌 取新鮮培養(yǎng)物接種至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,置30～35℃培養(yǎng)18～24 h；培養(yǎng)物用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成含菌數(shù)為50～l00 cfu/ml的菌懸液。

2.1.2 白色念珠菌 取新鮮培養(yǎng)物接種至改良馬丁培養(yǎng)基中,置23～28℃培養(yǎng)24～48 h；培養(yǎng)物用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成含菌數(shù)為50～100 cfu/ml的菌懸液。

2.1.3 黑曲霉 取新鮮培養(yǎng)物接種至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中,置23～28℃培養(yǎng) 5～7 d,加入3～5 ml含 0.05%聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液,將孢子洗脫。然后,采用適宜的方法吸出孢子懸液至無(wú)菌試管內(nèi),用含0.05%聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成含孢子數(shù)50～100 cfu/ml的孢子懸液。

2.2 供試液制備 取供試品10 g、十四烷酸異丙酯20 ml至含無(wú)菌玻璃珠的錐形瓶中,置45℃水浴中,充分振搖,使供試品溶解,再加入45℃ pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 ml,振搖5～10 min,置45℃水浴保溫、靜置使分層,取下層作為1：10的供試液。

2.3 細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證

2.3.1 試驗(yàn)組 各取1：10供試液、試驗(yàn)菌液1 ml,注入同一平皿中,立即傾注相應(yīng)瓊脂培養(yǎng)基,待凝結(jié)后,培養(yǎng),每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿,測(cè)定試驗(yàn)組的平均菌落數(shù)。

2.3.2 菌液組 取試驗(yàn)菌液1 ml,注入平皿中,立即傾注相應(yīng)瓊脂培養(yǎng)基,待凝結(jié)后,培養(yǎng),每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿,測(cè)定菌液組的平均菌落數(shù)。

2.3.3 供試品對(duì)照組 各取1：10供試液1 ml,注入平皿中,立即傾注相應(yīng)瓊脂培養(yǎng)基,待凝結(jié)后,培養(yǎng),測(cè)定供試品對(duì)照組的平均菌落數(shù)。

2.3.4 回收率計(jì)算 各菌株回收率(%)=(試驗(yàn)組的平均菌落數(shù)-供試品對(duì)照組的平均菌落數(shù))/菌液組的平均菌落數(shù)×100%。結(jié)果見(jiàn)表1(回收率應(yīng)不低于70%)。

由表1可知,用1 ml/皿供試液時(shí),各菌株的回收率均可達(dá)到70%以上,且3次均能重現(xiàn)試驗(yàn)結(jié)果,因此本品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)可用平皿法檢查(即1 ml/皿)。

2.4 控制菌檢查方法的驗(yàn)證 本品為局部給藥制劑,根據(jù)《中國(guó)藥典》2010年版,控制菌應(yīng)檢銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌。

2.4.1 銅綠假單胞菌檢查法的驗(yàn)證 分別取1：10供試液10 ml、銅綠假單胞菌菌懸液1 ml,加至膽鹽乳糖培養(yǎng)基100 ml中,按銅綠假單胞菌檢查法進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 計(jì)數(shù)驗(yàn)證各菌株回收率(%)

表2 控制菌驗(yàn)證結(jié)果

2.4.2 金黃色葡萄球菌檢查法的驗(yàn)證 分別取1：10供試液10 ml、金黃色葡萄球菌菌懸液1 ml,加至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基100 ml中,按金黃色葡萄球菌檢查法進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可見(jiàn),本品可用常規(guī)法檢查銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌。

3 討論

同一人工污染菌種及接種量的微生物在不同劑型藥品里可有不同的檢出結(jié)果,一些非水溶性油劑或軟膏劑,可因其與水難溶,其中污染的微生物難與培養(yǎng)基成分接觸或因缺氧而可能不生長(zhǎng)[2]。因此正確地制備供試液,使藥品中污染的微生物得以真實(shí)反映,是保證檢驗(yàn)結(jié)果正確可靠的重要前提。

以此次驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果為依據(jù),確定可采用常規(guī)法測(cè)定苯海拉明軟膏的細(xì)菌、霉菌、酵母菌數(shù)和控制菌銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌的檢查。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典(二部).北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010.

[2]馬緒榮,蘇德模.藥品微生物學(xué)檢驗(yàn)手冊(cè).北京：科學(xué)出版社,2001：56.