豬飼料中黃曲霉毒素多種檢測方法的比較

馮艷忠，劉煥奇，沈 偉，王兆山，耿艷紅 ，李鳳蘭，徐會連，秦國慶，陳赫書，王眾濤，吳賽輝，郭振華，何鑫淼，王文濤，肖紹科，丁元霞，劉 娣

（1.黑龍江省農業科學院畜牧研究所，哈爾濱 150086； 2.青島農業大學，山東 青島 266109；3.山東省濱州職業學院，山東 濱州256603 ；4.東北農業大學生命科學學院，哈爾濱 150030；5.日本自然農法國際研究中心；6. InnoTech Nutritiom Solutions ， Durand Road Winnipeg；7.山東省梁山縣第一職業高級中學，山東 濟寧 272605；8.吉林省通化縣動物疫病預防控制中心，吉林 通化 134100）

現有飼料原料中霉菌毒素檢測技術已經有國家標準，但檢測方法費用高、耗時長，難以滿足現場快速檢測的需要，也無法滿足國家對飼料質量安全監管和促進進出口貿易的迫切需要。因此，研究飼料中黃曲霉毒素安全檢測與評價技術特別重要，特別是豬飼料中的銅及其他礦物質含量較高，不同的檢測方法對結果可能帶來一定的干擾，應該引起我們的重視，因為，黃曲霉毒素關系到杜絕畜禽食品安全隱患與危害，促進經濟發展，維護社會穩定。

黃曲霉毒素的檢測方法從最初以薄層色譜法為主，發展到高效液相色譜法、微柱法、酶聯免疫吸附法等多種方法的普遍應用[1]。

1 薄層色譜法

薄層色譜法（TLC）是測定黃曲霉毒素的經典方法，是我國測定食品及飼料中AFB1的標準方法之一（GB/ T5009.23—1996）[2]。其原理是將樣品經過提取、柱層析、洗脫、濃縮、薄層分離后，在波長365nm紫外光下產生藍紫色或黃綠色熒光，黃曲霉毒素B1、B2產生藍紫色熒光，黃曲霉毒素G1、G2產生黃綠色熒光，并根據其在薄層上顯示的最低檢出量來確定其含量，是一種半定量檢測技術。TLC有單向展開法和雙向展開法，其中雙向展開法能進一步除去樣品中的雜質，提高靈敏度。TLC法由于設備簡單，易于普及，所以國內外仍在使用，但由于該法樣品前處理繁瑣，且提取和凈化效果不夠理想，提取液中雜質較多，因而在展開時影響斑點的熒光強度，雙向展開法雖避免了雜質干擾，但增加了操作步驟和時間。TLC法較適合于對黃曲霉毒素的定性檢測，是研究黃曲霉毒素初期所使用的主要方法。

薄層色譜法對樣品處理繁瑣，實驗過程復雜，所需時間多，易受雜質干擾，準確性差，對實驗人員危害大。

2 免疫化學方法

2.1 酶聯免疫吸附法

酶聯免疫吸附法是抗原或抗體吸附劑和用酶標記的抗體或抗原與標本中的待測物抗原和抗體起特異的免疫學反應，用測定酶活力的方法來增加測定的敏感度，是一種定性的方法。大致采用2種方法檢測黃曲霉毒素：一種是用雙抗體夾心法；另一種是用競爭法。免疫吸附法測定的試劑盒及配套儀器、方法被列入國家標準GB/T5009.22-2003食品中黃曲霉毒素B1的測定”[2]。Holladay等[45]采 取 間 接ELISA技術，檢測了抗黃曲霉毒素M1-牛血清白蛋白(AFM1-BSA)免疫原的特異性AFM1抗體。為了使用方便，利用酶聯免疫原理研制出黃曲霉毒素快速測試盒，能簡便地定量測定黃曲霉毒素含量。趙曉聯等[3]應用這種快速測試盒測定黃曲霉毒素含量，先用三氯甲烷提取樣品，過濾，收集并水浴揮干提取液，再用甲醇溶解，最后用專用黃曲霉毒素試劑盒測定。關于運用酶聯免疫法檢測AFB1的檢測報道也較多，目前國外已有較成熟的檢測食品及飼料中AFB1等真菌毒素的ELISA試劑盒出售，我國自20世紀90年代以來也有一些以ELISA檢測食品及飼料中AFB1的研究報道。如劉冬兒[4]報道了食品中AFB1的ELISA測定，線性范圍0.25～5.00ng/mL，檢測靈敏度達0.015μg/kg，比薄層色譜法提高300～400倍，回收率大于89.2%，精密度高，測定時間短，只需4h。酶聯免疫吸附法特異性強、靈敏度高、成本低，適于批量檢測，食品和飼料工業上可利用此方法來界定食品或飼料中黃曲霉毒素的超標問題。由于酶本身的不穩定性，用此方法檢驗黃曲霉毒素有可能帶來假陽性或假陰性結果，復雜樣品受干擾，檢測準確度不高。所以研制出的黃曲霉毒素快速測試盒多以測定最具毒性的種屬為主，酶聯免疫吸附法的檢測精度還有待于提高。

2.2 放射免疫法

放射免疫法與酶免疫法類似。但放射免疫法存在放射污染，已被淘汰。

2.3 親合層析法

利用免疫化學原理，抗體選擇性吸附抗原物質AFB1，具有高靈敏、高選擇、高特異性等特點，提高凈化效果及檢測靈敏度，減少有毒、有害試劑的使用，有利于操作人員的健康和環境保護。

3 高效液相色譜法

高效液相色譜法（HPLC）是近幾年發展起來的檢測AFB1方法，主要是用熒光檢測器檢測，在適宜的流動相條件下，采用反相C18柱，使多種黃曲霉毒素同時分離。文鏡[5]采用國產硅鎂吸附柱層析分離純化玉米中AFB1，用HPLC法檢測，方法簡便，純化效果好，最低檢出量為0.08ng，回收率為92.87%，該法制柱方便，而且降低了成本。李佐卿等[6]則將免疫學技術和HPLC法相結合采用免疫親和柱對樣品進行凈化，AFB1回收率達到97.3%，相關系數r=0.9994，最低檢出限為6.25pg，該法將提取、凈化、濃縮一次完成，大大簡化了前處理過程提高了工作效率及方法的靈敏度，但增加了成本。高效液相色譜法靈敏、分辨率高，可作定性、定量分析，同時可檢測多個黃曲霉毒素種類，適于大批量樣品的分析。高效液相色譜法儀器設備昂貴，技術水平要求高，每次實驗所使用的化學藥劑和處理途徑對試驗結果影響程度差別很大，對實驗結果的精度造成影響；樣品還需進行繁瑣的純化處理，不適合快速檢測。

4 微柱篩選法

微柱篩選法是將樣品提取液通過由氧化鋁與硅鎂吸附劑組成的微柱層析管，雜質被氧化鋁吸附，黃曲霉毒素被硅鎂吸附劑吸附，在365nm紫外線下呈藍紫色熒光，其熒光強度在一定范圍內與黃曲霉毒素的含量成正比，由于微柱不能分離黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2，故檢測結果為黃曲霉毒素的總量。微柱篩選法測定黃曲霉毒素，主要是用來檢驗黃曲霉毒素的存在與否以及快速篩選出超標樣品。要對黃曲霉毒素種類進行區分定量檢驗，則需要對不同黃曲霉毒素組分進行分離，再利用其他方法檢測。因此，微柱篩選法并不能完成整個黃曲霉毒素的檢測過程，僅適用于定性檢驗。

[1]JaneRoben.Noveltechnologiesforaflatoxindetectionopeningr e m a r k s[C].P r o c e d i n g so fthe2ndFungalGenomics,3rdF um on is inElimin a t i o nan d15thAflatoxinEliminationWorkshops,Texas,2002.54.

[2]GB8381—1987飼料中黃曲霉毒素B1的測定方法半定量薄層色譜法[S].北京：中國標準出版社,1987.

[3]SDHolladay.間接酶聯免疫吸附試驗檢測黃曲霉毒素抗體的評價[J].貴州畜牧獸醫,1993,17(1)：46-47.

[4]陳福生,李根久.醬油中黃曲霉毒素的酶聯免疫檢測[J].中國調味品,1998(8)：26-30.

[5]劉冬兒.酶聯免疫吸附分析法測定食品中的黃曲霉毒素B1[J].食品工業科技,2002,23(10)：79-89.

[6]文鏡.玉米中黃曲霉毒素B1的硅鎂吸附柱層析分離純化及HPLC的定量分析[J].食品科學,1996,17（1）：68-70.

[7]李佐卿,謝東軍,孫大為,等.免疫親和柱HPLC熒光檢測酒中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2[J].光譜試驗室,2001,18(1)：28-31.