β結(jié)合素與大鼠心肌缺血再灌注損傷的作用機(jī)制

李上海+梁偉鈞+張亞娟+吳鏗

[摘要]目的研究大鼠心肌缺血、缺血再灌注、無創(chuàng)性缺血預(yù)處理以及氯化鋰干預(yù)后心肌細(xì)胞β結(jié)合素的陽性表達(dá)率及細(xì)胞凋亡指數(shù)的變化，以探討β結(jié)合素與心肌缺血、缺血再灌注的關(guān)系以及可能機(jī)制。方法將入選的60只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)對照組（C）、缺血組（I）、缺血再灌注組（IR）、氯化鋰藥物預(yù)處理組（PPC）。以TUNEL方法評估各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況，以免疫組化方法測定各組大鼠心肌細(xì)胞中β結(jié)合素的表達(dá)，并計(jì)算各組大鼠的心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)及β結(jié)合素。結(jié)果與C組比較，I、IR、PPC四組凋亡指數(shù)均升高（P<0.05），各組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)比較的結(jié)果為：IR組>I組>PPC組>C組（各組兩兩比較均P<0.05）；各組心肌細(xì)胞β_cat陽性表達(dá)率比較的結(jié)果為：PPC組>C組>I組>IR組。β_cat陽性表達(dá)率與凋亡指數(shù)呈負(fù)相關(guān)，R=-0.90。結(jié)論β_cat陽性表達(dá)率與凋亡指數(shù)呈負(fù)相關(guān)，提示β_cat可以減少心肌缺血、缺血再灌注引起的細(xì)胞凋亡。

[關(guān)鍵詞]心肌缺血；心肌再灌注損傷；凋亡；β結(jié)合素；氯化鋰

缺血性心臟?。↖HD）是由多種病因?qū)е碌墓跔顒?dòng)脈血流量不足、心肌缺血缺氧，從而引起心肌功能障礙和器質(zhì)性病變。近年來，在心肌梗死后及時(shí)實(shí)施血運(yùn)重建（包括靜脈溶栓技術(shù)、動(dòng)脈搭橋術(shù)、導(dǎo)管技術(shù)等）是治療心肌梗死的最佳措施，挽救了大量患者的生命，但是血液復(fù)流后部分缺血的心肌組織代謝障礙和結(jié)構(gòu)破壞反而更加嚴(yán)重，這種現(xiàn)象被稱為心肌再灌注損傷（Myocardial Reperfusion Injury， MRI）[1]。MRI反常的抵消了開通血管的有益作用，甚至帶來致死性的損傷。目前的研究應(yīng)用證明抗氧化劑、鈣通道阻滯劑、ACEI等對減少M(fèi)RI后心肌細(xì)胞凋亡，改善心肌梗死后心功能等方面起到了重要作用，但效果并沒有達(dá)到理想水平，相關(guān)藥物仍在不斷研發(fā)中。無機(jī)離子鋰臨床上用來治療躁狂和抑郁癥。Klein和Melton于1996年首次報(bào)道了鋰離子可選擇性抑制糖原合成酶激酶_3β（GSK_3β）[2]，目前鋰離子已作為一種非常有用的工具用于對GSK_3β廣泛的生物學(xué)功能的研究，通過鋰的作用來研究抑制GSK_3β后細(xì)胞功能的改變[3]，GSK_3β及β結(jié)合素（β_catenin，β_cat）均是參與Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路關(guān)鍵介質(zhì)[4]。本實(shí)驗(yàn)擬通過應(yīng)用氯化鋰抑制GSK_3β對β_cat的磷酸化，使細(xì)胞內(nèi)β_cat含量增加，從而觀察β_cat變化含量與MRI的關(guān)系。

1資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：由廣東醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供健康雄性SPF級(jí)SD大鼠60只，2月齡，體重（200±20）克。隨機(jī)分為假手術(shù)對照組（C）、缺血組（I）、缺血再灌注組（IR）、氯化鋰藥物預(yù)處理組（PPC），共四組，每組15只。

1.2大鼠模型的制備：將大鼠禁食12h后，稱重，用烏拉坦腹腔注射麻醉（每100g體重大鼠用量為125mg）大鼠固定于手術(shù)臺(tái)。用銀針電極插入大鼠四肢皮下，接上心電圖機(jī)。心電圖定標(biāo)為2mv，檢測肢體二導(dǎo)聯(lián)。頸部切開皮膚，用玻璃分針鈍性分離皮下肌肉，暴露氣管，用眼科剪將氣管剪成T型開口，與動(dòng)物呼吸機(jī)相連，調(diào)節(jié)呼吸機(jī)參數(shù)為：潮氣量2～3ml/100g，頻率60次/分，吸呼比1∶2。術(shù)中注意觀察氣管插管是否通暢以及肺的膨脹情況。在胸骨左緣約1cm處剪開皮膚，鈍性分離肌層，剪斷3、4肋骨，用擴(kuò)胸器撐開肋骨，充分暴露術(shù)野。剪開心包，用帶5/0線的圓針在肺動(dòng)脈圓錐和左心耳之間進(jìn)針。C組只在左前降支埋線1h，不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈。I組結(jié)扎前降支1h。IR組先結(jié)扎前降支1h，然后松扎3h。PPC組先頸靜脈注射氯化鋰（劑量為15mg/kg），然后結(jié)扎左前降支1h，再灌注3h。

1.3采集標(biāo)本：模型制備成功后，取心尖缺血最明顯部位組織，切取小塊的心肌組織，立即置于4%多聚甲醛中固定。24h后，流水沖洗2h，先后以濃度為70%，80%，90%，95%，100%的乙醇脫水，每種濃度酒精的脫水時(shí)間均為2h，二甲苯透明30min。浸蠟，包埋。每個(gè)標(biāo)本的心肌組織都行4mm連續(xù)切片8張，在載玻片上鋪有一薄層多聚賴氨酸，切片貼于載玻片上。60℃烘烤4h，將石蠟切片放4℃下保存待測。

1.4實(shí)驗(yàn)室檢測：轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的末端標(biāo)記（TUNEL）技術(shù)檢測心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)，以免疫組化法檢測心肌細(xì)胞中β_cat的表達(dá)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均應(yīng)用SPSS 17.0軟件包處理，經(jīng)D檢驗(yàn)，顯示數(shù)據(jù)成正態(tài)分布，故實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x-±s）。各組樣本均數(shù)的兩兩比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2實(shí)驗(yàn)結(jié)果

C組有1只大鼠因誤剪動(dòng)脈大出血死亡，I組有2只因結(jié)扎冠狀動(dòng)脈后室顫死亡，IR組有2只因再灌注心律失常死亡，1只未發(fā)現(xiàn)再灌注退出實(shí)驗(yàn)，PPC有1只因頸靜脈注射時(shí)撕裂頸靜脈出血較多死亡。共用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物60只，最終獲得53只大鼠的完整資料。

2.1形態(tài)學(xué)觀察：在高倍顯微鏡下（20×20）觀察經(jīng)TUNEL技術(shù)處理過的心肌組織切片，正常心肌細(xì)胞的細(xì)胞核呈淡藍(lán)色，凋亡心肌細(xì)胞的細(xì)胞核被染成深淺不一的棕褐色。假手術(shù)對照組大多數(shù)細(xì)胞核呈藍(lán)色，極少數(shù)被染成棕褐色；IR組切片大量細(xì)胞核深染；PPC組也可見部分細(xì)胞核染成棕褐色，其數(shù)量較C組多但較IR組少。

在高倍顯微鏡下（20×20）觀察經(jīng)免疫組化處理過的心肌組織切片，陽性表達(dá)β_cat的細(xì)胞表現(xiàn)為：心肌閏盤處有與心肌纖維垂直的棕褐色條帶，細(xì)胞漿被染成棕褐色，少數(shù)細(xì)胞核被染成棕褐色，細(xì)胞核被染成棕褐色細(xì)胞為β_cat陽性表達(dá)細(xì)胞。在PPC組可見大量β_cat陽性表達(dá)信號(hào)，而其余三組相對較少（見圖5～8）。圖1C組心肌細(xì)胞TUNEL觀察（20×20）圖2I組心肌細(xì)胞TUNEL觀察（20×20）圖3IR組心肌細(xì)胞TUNEL觀察（20×20）圖4PPC組心肌細(xì)胞TUNEL觀察（20×20）圖5C組大鼠β_cat觀察（20×20）圖6I組大鼠β_cat觀察（20×20）圖7IR組大鼠β_cat觀察（20×20）圖8PPC組大鼠β_cat觀察（20×20）

2.2各組細(xì)胞凋亡指數(shù)、β_cat陽性表達(dá)率比較：.。各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)C組最低（2.0±0.12），I組明顯增加（5.50±1.11），IR組進(jìn)一步增加（22.21±2.31），為各組最高，PPC組較IR組減少（4.35±1.57），但仍較C組高。與C組比較，I、IR組β_cat的含量均降低（P<0.05），而PPC組明顯升高（P<0.05），各組心肌細(xì)胞β_cat陽性表達(dá)率比較的結(jié)果為：PPC組>C組>I組>IR組。

3討論

IHD是嚴(yán)重威脅人類健康的心臟病，以往對其研究主要著重于改善血供，減緩缺血區(qū)心室重構(gòu)，進(jìn)而改善心功能。近年來越來越多的學(xué)者開始關(guān)注再灌注損傷影響。MRI是影響患者冠狀動(dòng)脈再通后心功能的重要因素?，F(xiàn)已證明再灌注損傷可以通過鈣超載、氧自由基作用、能量代謝障礙等誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致再灌注心律失常、心力衰竭，甚至猝死。缺血再灌注心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生同樣受凋亡相關(guān)基因的調(diào)控，其中Bcl_2基因家族被認(rèn)為是最重要的細(xì)胞凋亡基因，包括Bcl_2、Bax、Bcl_w、Bad等[5]。Bcl_2是第一個(gè)被認(rèn)為有抑制凋亡作用的基因。當(dāng)Bcl_2高表達(dá)時(shí)，Bcl_2與Bax結(jié)合形成異型二聚體Bcl_2/Bax，抑制凋亡的發(fā)生[6]。

β_cat是一種多功能蛋白質(zhì)，是Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路的關(guān)鍵介質(zhì)，能通過與多種蛋白結(jié)合參與細(xì)胞和組織的發(fā)育分化、損傷修復(fù)，其下游靶基因多與細(xì)胞周期調(diào)控有關(guān)。當(dāng)受到信號(hào)刺激后可啟動(dòng)或抑制下游靶基因的表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化和凋亡。β結(jié)合素進(jìn)入細(xì)胞核與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，調(diào)控Bcl_2基因家族的表達(dá)、啟動(dòng)增殖相關(guān)或抗凋亡基因的轉(zhuǎn)錄。近年來，β結(jié)合素在心臟方面的研究涉及到心室重塑、心肌損傷愈合等與心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)的疾病中[7，8]。β_cat在心肌缺血再灌注損傷方面的研究較少，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示β_cat能減少細(xì)胞凋亡，減輕心肌缺血再灌注損傷，可能是通過調(diào)控Bcl_2基因家族的表達(dá)，提高Bcl_2/Bax比率的機(jī)制。

無機(jī)離子鋰作為GSK_3β的選擇性抑制劑已有很多報(bào)道[9，10]。鋰離子模擬GSK_3N端的11肽，能夠抑制GSK_3β的預(yù)磷酸化底物。小分子的鋰離子正好帶正電的口袋，只選擇性的抑制GSK_3β的預(yù)磷酸化底物。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用氯化鋰競爭性的阻斷GSK_3β與β_cat的結(jié)合，成功的使β_cat在胞漿內(nèi)大量聚集。如圖3.26所示不但細(xì)胞漿內(nèi)可見β_cat大量聚集，同時(shí)亦可見細(xì)胞核內(nèi)β_cat的陽性表達(dá)，而其余各組（圖5～8）僅見β_cat在少量細(xì)胞核表達(dá)。也就是說，本實(shí)驗(yàn)通過氯化鋰的作用，干擾了GSK_3β和β_cat之間的相互作用，進(jìn)一步干擾了Wnt信號(hào)通路的后細(xì)胞效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示大鼠以氯化鋰預(yù)處理后β_cat的表達(dá)增強(qiáng)。由表1所見，PPC組β_cat的陽性表達(dá)率是C組的2倍多；各組心肌細(xì)胞β_cat表達(dá)陽性率比較的結(jié)果為：PPC組>C組>I組>IR組。I組、IR組兩組的凋亡指數(shù)高于C組，符合既往的研究成果，從側(cè)面反映了本研究的可靠性；C組β_cat陽性率較I組、IR組兩組高，結(jié)合三組凋亡指數(shù)我們有理由認(rèn)為β_cat能抑制MRI誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。β_cat的表達(dá)PPC組較C組多，從實(shí)驗(yàn)推理似乎凋亡指數(shù)PPC組較C組少，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PPC組凋亡指數(shù)較C組高，考慮可能與缺血再灌注可能激活其他的凋亡途徑有關(guān)。該結(jié)果與β_cat可以減少心肌細(xì)胞凋亡的推測相吻合。

基于前人的研究成果，再結(jié)合本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果，我們認(rèn)為：β_cat在心肌再灌注損傷誘導(dǎo)的凋亡中扮演著重要的角色，β_cat在心肌細(xì)胞中含量與細(xì)胞凋亡率呈負(fù)相關(guān)，β_cat通過調(diào)解Bcl_2的表達(dá)對細(xì)胞凋亡有一定的抑制作用，其機(jī)制涉及GSK_3β以及Bcl_2/Bax比率。以上實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)了β_cat可以減緩心肌再灌注損傷誘發(fā)的凋亡，對缺血性心臟病的基礎(chǔ)研究提供了信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的環(huán)節(jié)的新思路，對臨床上防治缺血性心臟病的藥物干預(yù)也有一定的借鑒作用。

參考文獻(xiàn)

[1]陳主初，郭恒怡，王樹人.病理生理學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2005：190-202.

[2]Klein PS， Melton DA.A molecular mechanism for the effect of lithium on development[J]. Proc Natl Acad Sci，1996，93（16）：8455-8459.

[3]Pandey GN， Ren X， Rizavi HS， et al.Glycogen synthase kinase_3beta in the platelets of patients with mood disorders： effect of treatment[J]. Psychiatr Res，2010，44（3）：143-148.

[4]Nelson WJ， Nusse R. Convergence of Wnt， beta_catenin， and cadherin pathways[J]. Science，2004，303（5663）：1483-1487.

[5]Brown R. The Bcl_2 family of proteins[J]. Br Med Bull，1997，53（3）：466-477.

[6]Mackey TJ， Borkowski A， Amin P， et al. bcl_2/bax ratio as a predictive marker for therapeutic response to radiotherapy in patients with prostate cancer[J]. Urology，1998，52（6）：1085-1090.

[7]Brade T， Mnner J， Kühl M. The role of Wnt signalling in cardiac development and tissue remodelling in the mature heart[J]. Cardiovasc Res，2006，72（2）：198-209.

[8]Baurand A， Zelarayan L， Betney R， et al. β_Catenin Downregulation Is Required for Adaptive Cardiac Remodeling[J]. Circ Res，2007，100（9）：1353-1362.

[9] Xu CM， Wang J， Wu P， et al. Glycogen synthase kinase_3β in the nucleus accumbens core mediates cocaine_induced behavioral sensitization[J]. Neurochem，2009，111（6）：1357-1368.

[10]Park HJ， Kim HJ， Bae GS， et al. Selective GSK_3β inhibitors attenuate the cisplatin_induced cytotoxicity of auditory cells[J].Hear Res，2009，257（1-2）：53-62.

2.2各組細(xì)胞凋亡指數(shù)、β_cat陽性表達(dá)率比較：.。各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)C組最低（2.0±0.12），I組明顯增加（5.50±1.11），IR組進(jìn)一步增加（22.21±2.31），為各組最高，PPC組較IR組減少（4.35±1.57），但仍較C組高。與C組比較，I、IR組β_cat的含量均降低（P<0.05），而PPC組明顯升高（P<0.05），各組心肌細(xì)胞β_cat陽性表達(dá)率比較的結(jié)果為：PPC組>C組>I組>IR組。

3討論

IHD是嚴(yán)重威脅人類健康的心臟病，以往對其研究主要著重于改善血供，減緩缺血區(qū)心室重構(gòu)，進(jìn)而改善心功能。近年來越來越多的學(xué)者開始關(guān)注再灌注損傷影響。MRI是影響患者冠狀動(dòng)脈再通后心功能的重要因素?，F(xiàn)已證明再灌注損傷可以通過鈣超載、氧自由基作用、能量代謝障礙等誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致再灌注心律失常、心力衰竭，甚至猝死。缺血再灌注心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生同樣受凋亡相關(guān)基因的調(diào)控，其中Bcl_2基因家族被認(rèn)為是最重要的細(xì)胞凋亡基因，包括Bcl_2、Bax、Bcl_w、Bad等[5]。Bcl_2是第一個(gè)被認(rèn)為有抑制凋亡作用的基因。當(dāng)Bcl_2高表達(dá)時(shí)，Bcl_2與Bax結(jié)合形成異型二聚體Bcl_2/Bax，抑制凋亡的發(fā)生[6]。

β_cat是一種多功能蛋白質(zhì)，是Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路的關(guān)鍵介質(zhì)，能通過與多種蛋白結(jié)合參與細(xì)胞和組織的發(fā)育分化、損傷修復(fù)，其下游靶基因多與細(xì)胞周期調(diào)控有關(guān)。當(dāng)受到信號(hào)刺激后可啟動(dòng)或抑制下游靶基因的表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化和凋亡。β結(jié)合素進(jìn)入細(xì)胞核與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，調(diào)控Bcl_2基因家族的表達(dá)、啟動(dòng)增殖相關(guān)或抗凋亡基因的轉(zhuǎn)錄。近年來，β結(jié)合素在心臟方面的研究涉及到心室重塑、心肌損傷愈合等與心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)的疾病中[7，8]。β_cat在心肌缺血再灌注損傷方面的研究較少，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示β_cat能減少細(xì)胞凋亡，減輕心肌缺血再灌注損傷，可能是通過調(diào)控Bcl_2基因家族的表達(dá)，提高Bcl_2/Bax比率的機(jī)制。

無機(jī)離子鋰作為GSK_3β的選擇性抑制劑已有很多報(bào)道[9，10]。鋰離子模擬GSK_3N端的11肽，能夠抑制GSK_3β的預(yù)磷酸化底物。小分子的鋰離子正好帶正電的口袋，只選擇性的抑制GSK_3β的預(yù)磷酸化底物。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用氯化鋰競爭性的阻斷GSK_3β與β_cat的結(jié)合，成功的使β_cat在胞漿內(nèi)大量聚集。如圖3.26所示不但細(xì)胞漿內(nèi)可見β_cat大量聚集，同時(shí)亦可見細(xì)胞核內(nèi)β_cat的陽性表達(dá)，而其余各組（圖5～8）僅見β_cat在少量細(xì)胞核表達(dá)。也就是說，本實(shí)驗(yàn)通過氯化鋰的作用，干擾了GSK_3β和β_cat之間的相互作用，進(jìn)一步干擾了Wnt信號(hào)通路的后細(xì)胞效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示大鼠以氯化鋰預(yù)處理后β_cat的表達(dá)增強(qiáng)。由表1所見，PPC組β_cat的陽性表達(dá)率是C組的2倍多；各組心肌細(xì)胞β_cat表達(dá)陽性率比較的結(jié)果為：PPC組>C組>I組>IR組。I組、IR組兩組的凋亡指數(shù)高于C組，符合既往的研究成果，從側(cè)面反映了本研究的可靠性；C組β_cat陽性率較I組、IR組兩組高，結(jié)合三組凋亡指數(shù)我們有理由認(rèn)為β_cat能抑制MRI誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。β_cat的表達(dá)PPC組較C組多，從實(shí)驗(yàn)推理似乎凋亡指數(shù)PPC組較C組少，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PPC組凋亡指數(shù)較C組高，考慮可能與缺血再灌注可能激活其他的凋亡途徑有關(guān)。該結(jié)果與β_cat可以減少心肌細(xì)胞凋亡的推測相吻合。

基于前人的研究成果，再結(jié)合本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果，我們認(rèn)為：β_cat在心肌再灌注損傷誘導(dǎo)的凋亡中扮演著重要的角色，β_cat在心肌細(xì)胞中含量與細(xì)胞凋亡率呈負(fù)相關(guān)，β_cat通過調(diào)解Bcl_2的表達(dá)對細(xì)胞凋亡有一定的抑制作用，其機(jī)制涉及GSK_3β以及Bcl_2/Bax比率。以上實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)了β_cat可以減緩心肌再灌注損傷誘發(fā)的凋亡，對缺血性心臟病的基礎(chǔ)研究提供了信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的環(huán)節(jié)的新思路，對臨床上防治缺血性心臟病的藥物干預(yù)也有一定的借鑒作用。

參考文獻(xiàn)

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[4]Nelson WJ， Nusse R. Convergence of Wnt， beta_catenin， and cadherin pathways[J]. Science，2004，303（5663）：1483-1487.

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[7]Brade T， Mnner J， Kühl M. The role of Wnt signalling in cardiac development and tissue remodelling in the mature heart[J]. Cardiovasc Res，2006，72（2）：198-209.

[8]Baurand A， Zelarayan L， Betney R， et al. β_Catenin Downregulation Is Required for Adaptive Cardiac Remodeling[J]. Circ Res，2007，100（9）：1353-1362.

[9] Xu CM， Wang J， Wu P， et al. Glycogen synthase kinase_3β in the nucleus accumbens core mediates cocaine_induced behavioral sensitization[J]. Neurochem，2009，111（6）：1357-1368.

[10]Park HJ， Kim HJ， Bae GS， et al. Selective GSK_3β inhibitors attenuate the cisplatin_induced cytotoxicity of auditory cells[J].Hear Res，2009，257（1-2）：53-62.

2.2各組細(xì)胞凋亡指數(shù)、β_cat陽性表達(dá)率比較：.。各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)C組最低（2.0±0.12），I組明顯增加（5.50±1.11），IR組進(jìn)一步增加（22.21±2.31），為各組最高，PPC組較IR組減少（4.35±1.57），但仍較C組高。與C組比較，I、IR組β_cat的含量均降低（P<0.05），而PPC組明顯升高（P<0.05），各組心肌細(xì)胞β_cat陽性表達(dá)率比較的結(jié)果為：PPC組>C組>I組>IR組。

3討論

IHD是嚴(yán)重威脅人類健康的心臟病，以往對其研究主要著重于改善血供，減緩缺血區(qū)心室重構(gòu)，進(jìn)而改善心功能。近年來越來越多的學(xué)者開始關(guān)注再灌注損傷影響。MRI是影響患者冠狀動(dòng)脈再通后心功能的重要因素?，F(xiàn)已證明再灌注損傷可以通過鈣超載、氧自由基作用、能量代謝障礙等誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致再灌注心律失常、心力衰竭，甚至猝死。缺血再灌注心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生同樣受凋亡相關(guān)基因的調(diào)控，其中Bcl_2基因家族被認(rèn)為是最重要的細(xì)胞凋亡基因，包括Bcl_2、Bax、Bcl_w、Bad等[5]。Bcl_2是第一個(gè)被認(rèn)為有抑制凋亡作用的基因。當(dāng)Bcl_2高表達(dá)時(shí)，Bcl_2與Bax結(jié)合形成異型二聚體Bcl_2/Bax，抑制凋亡的發(fā)生[6]。

β_cat是一種多功能蛋白質(zhì)，是Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路的關(guān)鍵介質(zhì)，能通過與多種蛋白結(jié)合參與細(xì)胞和組織的發(fā)育分化、損傷修復(fù)，其下游靶基因多與細(xì)胞周期調(diào)控有關(guān)。當(dāng)受到信號(hào)刺激后可啟動(dòng)或抑制下游靶基因的表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化和凋亡。β結(jié)合素進(jìn)入細(xì)胞核與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，調(diào)控Bcl_2基因家族的表達(dá)、啟動(dòng)增殖相關(guān)或抗凋亡基因的轉(zhuǎn)錄。近年來，β結(jié)合素在心臟方面的研究涉及到心室重塑、心肌損傷愈合等與心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)的疾病中[7，8]。β_cat在心肌缺血再灌注損傷方面的研究較少，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示β_cat能減少細(xì)胞凋亡，減輕心肌缺血再灌注損傷，可能是通過調(diào)控Bcl_2基因家族的表達(dá)，提高Bcl_2/Bax比率的機(jī)制。

無機(jī)離子鋰作為GSK_3β的選擇性抑制劑已有很多報(bào)道[9，10]。鋰離子模擬GSK_3N端的11肽，能夠抑制GSK_3β的預(yù)磷酸化底物。小分子的鋰離子正好帶正電的口袋，只選擇性的抑制GSK_3β的預(yù)磷酸化底物。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用氯化鋰競爭性的阻斷GSK_3β與β_cat的結(jié)合，成功的使β_cat在胞漿內(nèi)大量聚集。如圖3.26所示不但細(xì)胞漿內(nèi)可見β_cat大量聚集，同時(shí)亦可見細(xì)胞核內(nèi)β_cat的陽性表達(dá)，而其余各組（圖5～8）僅見β_cat在少量細(xì)胞核表達(dá)。也就是說，本實(shí)驗(yàn)通過氯化鋰的作用，干擾了GSK_3β和β_cat之間的相互作用，進(jìn)一步干擾了Wnt信號(hào)通路的后細(xì)胞效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示大鼠以氯化鋰預(yù)處理后β_cat的表達(dá)增強(qiáng)。由表1所見，PPC組β_cat的陽性表達(dá)率是C組的2倍多；各組心肌細(xì)胞β_cat表達(dá)陽性率比較的結(jié)果為：PPC組>C組>I組>IR組。I組、IR組兩組的凋亡指數(shù)高于C組，符合既往的研究成果，從側(cè)面反映了本研究的可靠性；C組β_cat陽性率較I組、IR組兩組高，結(jié)合三組凋亡指數(shù)我們有理由認(rèn)為β_cat能抑制MRI誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。β_cat的表達(dá)PPC組較C組多，從實(shí)驗(yàn)推理似乎凋亡指數(shù)PPC組較C組少，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PPC組凋亡指數(shù)較C組高，考慮可能與缺血再灌注可能激活其他的凋亡途徑有關(guān)。該結(jié)果與β_cat可以減少心肌細(xì)胞凋亡的推測相吻合。

基于前人的研究成果，再結(jié)合本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果，我們認(rèn)為：β_cat在心肌再灌注損傷誘導(dǎo)的凋亡中扮演著重要的角色，β_cat在心肌細(xì)胞中含量與細(xì)胞凋亡率呈負(fù)相關(guān)，β_cat通過調(diào)解Bcl_2的表達(dá)對細(xì)胞凋亡有一定的抑制作用，其機(jī)制涉及GSK_3β以及Bcl_2/Bax比率。以上實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)了β_cat可以減緩心肌再灌注損傷誘發(fā)的凋亡，對缺血性心臟病的基礎(chǔ)研究提供了信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的環(huán)節(jié)的新思路，對臨床上防治缺血性心臟病的藥物干預(yù)也有一定的借鑒作用。

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