谷胱甘肽對胰島素淀粉樣纖維化的抑制作用

李紅紅，曾成鳴(陜西師范大學化學與化工學院，西安 710062)

一些蛋白質(zhì)或多肽在一定的條件下可產(chǎn)生錯誤折疊而形成淀粉樣纖維。目前已知多種人類疾病與這類淀粉樣纖維有關[1-2]。這些淀粉樣纖維通過與細胞膜作用，直接導致細胞損害，還可以啟動或者改變一系列生理生化途徑，誘導細胞凋亡。研究表明，除了膜蛋白和纖維蛋白外，幾乎所有的蛋白質(zhì)都可以在一定的條件下形成淀粉樣纖維。不同的蛋白質(zhì)或者多肽形成的淀粉樣纖維都具有共同的特征，包括較高含量的β折疊結構、無分枝的纖維形態(tài)、特殊的表面物理化學性質(zhì)及細胞毒性等[3-4]。胰島素是一種常用的多肽類藥物，由51個氨基酸組成，在一定的條件下，同樣能夠形成淀粉樣纖維，被認為是最具有淀粉樣纖維化傾向的蛋白之一[5]。雖然目前還沒有證據(jù)表明，胰島素纖維化與任何疾病相關，但作為藥物應用時，胰島素纖維狀聚集體可能具有免疫原性，在注射后可產(chǎn)生一定的不良反應。此外，由于胰島素極易形成淀粉樣纖維，通常將其作為研究多肽淀粉樣纖維化、篩選抗纖維化藥物以及研究纖維細胞毒性分子機制的模型蛋白。

谷胱甘肽 (glutathione, GSH)是一種由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成的三肽，在生命體系的氧化-抗氧化過程中扮演著重要的角色。本文采用牛胰島素作為研究對象，探索GSH對蛋白質(zhì)纖維化的作用及其分子機制，以及GSH對淀粉樣纖維細胞的毒性作用。

1 儀器與材料

1.1儀器 LS-55型熒光分光度計(美國Perkin-Elmer公司)；H-600型透射電鏡(日本Hitachi公司)；Quanta 200型環(huán)境掃描電鏡(Philips-FEI, The Netherland)。

1.2試藥 牛胰島素、還原型谷胱甘肽(GSH)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)、氨基酸、硫黃素(ThT)和8-苯胺-1-萘磺酸(ANS)，購自Sigma-Aldrich公司；其他化合物均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.3細胞 新鮮全血取自健康志愿者，枸櫞酸抗凝。按文獻方法[4]分離紅細胞，制備成20%紅細胞懸液，4 ℃保存，當天使用。

2 方法

2.1胰島素淀粉樣纖維的制備 將牛胰島素溶解于10 mmol·L-1鹽酸溶液(pH2.0)中，加入不同濃度的GSH，使胰島素的終質(zhì)量濃度為1 g·L-1，于37 ℃下在具有震蕩功能的水浴中孵育，震蕩頻率設定為90 r·min-1，按一定的時間間隔取樣。成熟纖維保存在4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

2.2纖維生長曲線的繪制 取10 μL樣品，加至含有10 μmol·L-1ThT的Tris-HCl溶液(10 mmol·L-1；pH8.0)中，混勻，于激發(fā)波長440 nm、發(fā)射波長484 nm條件下進行熒光分析，按照熒光強度-孵育時間制作纖維生長曲線。

2.3ANS熒光檢測 配制1 mmol·L-1的ANS溶液，加入到含有10 μL胰島素樣品的10 mmol·L-1Tris-HCl 溶液(pH8.0)中，使ANS的濃度為10 μmol·L-1，混勻后進行熒光分析，準確記錄在400～600 nm范圍內(nèi)最大發(fā)射波長相應熒光強度數(shù)值。激發(fā)波長370 nm。

2.4纖維形態(tài)觀察 取5 μL成熟胰島素纖維，按1︰5加入重蒸水稀釋，于鍍膜銅網(wǎng)上點樣，濾紙吸干后滴加10 μL雙氧鈾(20 g·L-1)溶液染色3 min，透射電子顯微鏡下觀察、拍照。

2.5紅細胞聚集 取新鮮配制的紅細胞，加入胰島素纖維(孵育15 h)，用等滲PBS稀釋，纖維終質(zhì)量濃度為30 mg·L-1，紅細胞終體積分數(shù)為2%，37 ℃孵育1 h，離心分離，經(jīng)戊二醛(10 mL·L-1)固定、丙酮系列脫水和噴金后，掃描電鏡觀察并記錄。

3 結果

在37 ℃、90 r·min-1震蕩的條件下孵育，胰島素可在11 h左右形成成熟的淀粉樣纖維，纖維的生長過程可以采用ThT熒光法進行監(jiān)測。ThT是一種能夠與淀粉樣纖維特異性結合的熒光探針，采用440 nm波長的光激發(fā)，可以觀察到482 nm的特征熒光發(fā)射峰。當胰島素分子單體通過聚集形成淀粉樣纖維時，隨著其二級結構轉變，β折疊含量增高，與ThT分子結合時出現(xiàn)熒光增強的現(xiàn)象。與大多數(shù)蛋白質(zhì)纖維化過程相似，胰島素的纖維生長過程也具有成核-聚合的動力學特征[6]，即纖維化主要包括成核、生長和成熟3個階段，ThT熒光曲線表現(xiàn)為S型特征。

GSH可以抑制胰島素的淀粉樣纖維化，其抑制效應與濃度呈正相關，當GSH的濃度達到10 mmol·L-1時，纖維化被完全抑制，ThT熒光強度一直處于較低的范圍。2和5 mmol·L-1的GSH也具有明顯的抑制作用，雖然ThT熒光強度有所升高，但熒光強度增加的幅度比較小，時間也明顯延后，表明較低濃度的GSH可延緩胰島素的纖維化，并減少生成的纖維量。

為了探索淀粉樣纖維的表面性質(zhì)，我們采用ANS熒光檢測胰島素在纖維化過程中，聚集體表面的疏水性變化。ANS是一種常用的蛋白質(zhì)分子疏水區(qū)域結構分析的熒光探針[7]，以370 nm波長的光激發(fā)ANS溶液，在530 nm處可觀察到一發(fā)射峰。當ANS與其他物質(zhì)分子的疏水區(qū)結合時，熒光的強度增強，發(fā)射峰藍移。隨著胰島素的纖維化，ANS熒光逐漸增強，表明胰島素纖維具有較強的表面疏水性。與ThT熒光變化趨勢相比較，在孵育過程中，ANS熒光強度上升比較快，說明胰島素通過去折疊改變了分子的構象，分子內(nèi)部的疏水結構暴露在溶劑中，從而加速了聚集體的形成。

在與GSH共存的情況下，胰島素結合的ANS熒光強度明顯降低，當GSH濃度達到5 mmol·L-1時，在整個孵育過程中，胰島素的ANS熒光沒有明顯升高，與ThT熒光的趨勢大致相同，說明GSH在抑制胰島素纖維化的同時，也減少了胰島素聚集體的表面疏水性。見圖1。

圖1 胰島素淀粉樣纖維透射電鏡圖

本實驗條件下形成的胰島素纖維的直徑在6～30 nm之間，長度分布為150～3 700 nm (圖1A)。在10 mmol·L-1GSH存在的條件下，可發(fā)現(xiàn)短小的原纖維狀的聚集體結構，無典型的淀粉樣纖維特征(圖1B)，說明在與GSH共存孵育的情況下，胰島素淀粉樣纖維的生長受到抑制。

ANS熒光強度的變化趨勢表明，胰島素在形成淀粉樣纖維后，聚集體具有較強的表面疏水性，這是淀粉樣纖維具有細胞毒性的主要原因之一。具有較強表面疏水性的蛋白纖維能夠插入到細胞膜的疏水層，干擾細胞膜結構，導致膜通透性增加[7]。本文利用紅細胞探索不同條件下形成的胰島素聚集體的細胞毒性作用，如圖2所示。正常紅細胞呈雙凹面圓盤狀，直徑約8 μm (圖2A)。經(jīng)50 mg·L-1胰島素纖維處理后，細胞產(chǎn)生型變和聚集，一些細胞發(fā)生破裂和缺損(圖2B)。在10 mmol·L-1GSH存在的條件下，形成的胰島素聚集體(50 mg·L-1)對細胞無明顯作用(圖2C)，表明GSH通過抑制胰島素的淀粉樣纖維化，減小了形成的聚集體對細胞的損害作用。

圖2 胰島素纖維誘導紅細胞損害的掃描電鏡圖

為了探索GSH抑制胰島素淀粉樣纖維化的分子機制，我們考察了與GSH結構相關的幾種化合物對胰島素淀粉樣纖維化的作用，包括組成GSH的3種氨基酸即谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸以及氧化型谷胱甘肽(GSSG)。結果表明，只有半胱氨酸對胰島素的纖維化有抑制作用，不含有巰基的化合物GSSG、谷氨酸和甘氨酸無作用，但半胱氨酸的抑制作用要低于GSH的抑制作用，相同濃度下只有GSH的35%左右。這些結果表明，GSH抑制胰島素的纖維化與其巰基結構相關。

4 討論

胰島素在酸化、升高溫度、振蕩和表面吸附等條件下，容易產(chǎn)生聚集并形成淀粉樣纖維。在振蕩條件下，胰島素形成纖維的速度大大加快，所需要的溫度也隨之降低。在本文所采用的條件下，胰島素可在11 h左右完成淀粉樣纖維化，生成的纖維具有其他淀粉樣纖維相同的物理化學特性和細胞毒性。胰島素纖維生成的動力學過程包括單體→成核→生長→延長→成熟等階段，大致對應于ThT熒光曲線中的延遲期、生長期和成熟期[6]。在胰島素形成纖維的過程中，分子中的部分二級結構由α螺旋轉化為β折疊，這種構象的轉變可導致內(nèi)部的疏水基團暴露于分子外層，進而使形成的纖維具有較高的表面疏水性。淀粉樣纖維的表面疏水性被認為是其細胞毒性的主要因素之一，纖維的表面疏水性越強，其細胞毒性越大[2,7]，與本文的ANS熒光分析和細胞實驗結果基本一致。

GSH是一種可以由人類細胞自然合成的三肽，在體內(nèi)參與一系列的代謝過程，同時與其氧化型GSSG組成重要的氧化-還原對，參與體內(nèi)氧化還原過程。所以，GSH是生命體系內(nèi)的一種重要的代謝調(diào)節(jié)物質(zhì)和抗氧化劑。同時，GSH還是一種臨床上的常用藥物，可用于多種疾病的治療和輔助治療。本文的實驗結果表明，GSH能夠有效地抑制胰島素的淀粉樣纖維化，而其氧化型GSSG不具有這種作用，表明GSH抑制胰島素纖維化的作用可能來源于分子中的巰基結構。有研究表明，二硫鍵在蛋白質(zhì)淀粉樣纖維化過程中具有重要作用[8]。胰島素分子中含有3個二硫鍵，在纖維化過程中，胰島素分子產(chǎn)生構象轉變，使處于內(nèi)部的二硫鍵外露，這樣GSH分子可通過巰基-二硫鍵的交換反應使胰島素分子產(chǎn)生構象改變，從而阻斷纖維化進程。雖然半胱氨酸是GSH的分子結構成分，也含有巰基，但它對胰島素纖維化的抑制作用比較弱，這說明GSH的短肽結構在與胰島素分子的作用中的重要性，但具體機制尚不清楚，還需要進一步探索。

綜上所述，胰島素在酸性介質(zhì)和振蕩的條件下，可以在37 ℃形成淀粉樣纖維。GSH能夠抑制胰島素的淀粉樣纖維化，并降低形成的纖維聚集體的表面疏水性，從而降低了胰島素纖維對細胞的損害作用。GSH的抗淀粉樣纖維化作用與分子中的巰基結構有關。本文的實驗結果對研發(fā)蛋白質(zhì)淀粉樣纖維化相關疾病的治療藥物具有重要意義，同時也為尋找胰島素穩(wěn)定劑提供了新的選擇。

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