聯(lián)合應(yīng)用氯喹增加人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U343細(xì)胞對(duì)Bcl-2抑制劑ABT737的敏感性

趙金川 ，趙 燕 ，侯 坤 ，張 揚(yáng) ，牟 榮 ，柳敬偉*

(1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院二部 神經(jīng)外科， 吉林 長(zhǎng)春130031；2.吉林省人民醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，吉林 長(zhǎng)春130021；3.吉林金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司)

Bcl-2抑制劑是一種新型的很有應(yīng)用前景的抗腫瘤藥物，它通過抑制促存活Bcl-2家族蛋白的表達(dá)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。近年來,ABT-737、ABT-263、棉酚、apogossypol、TW-37、obatoclax、HA14-1等Bcl-2小分子抑制劑已成為研究的熱點(diǎn)，臨床前試驗(yàn)表明該類藥物單藥對(duì)某些腫瘤有效，與放化療聯(lián)合使用具有明顯的協(xié)同效果[1]。 Bcl-2抑制劑可模擬僅有BH3結(jié)構(gòu)域蛋白的功能，其中ABT-737已進(jìn)入二期臨床階段，它在體外表現(xiàn)出與Bcl-xL、Bcl-2 和Bcl-w 有較高親和力[2]，而對(duì)Bcl-B、Bfl-1、Mcl-1親和力較低[3]。ABT-737表現(xiàn)出較強(qiáng)的單藥活性，尤其是對(duì)白血病，淋巴瘤，小細(xì)胞肺癌，但是也經(jīng)常出現(xiàn)耐藥[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)，Mcl-1在早期不能被靶向，因而導(dǎo)致ABT-737耐藥，但是ABT-737與其它的抗腫瘤藥物聯(lián)用可以增加腫瘤細(xì)胞死亡[6]。

目前，累積的證據(jù)表明氯喹可提高癌癥細(xì)胞對(duì)放療和化療藥物的敏感性，氯喹傳統(tǒng)上用于治療或預(yù)防瘧疾，機(jī)制是通過堿化溶酶體酸性環(huán)境，抑制其蛋白酶活性[7]。氯喹也可通過其免疫抑制特性用于自身免疫性疾病，但是其抗腫瘤機(jī)制尚不清楚[8，9]。因此，本研究擬考察ABT-737和氯喹兩種不同機(jī)制的抗腫瘤藥物聯(lián)用對(duì)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U343細(xì)胞殺傷效應(yīng)，以及二者應(yīng)用是否具有協(xié)同作用。

1 材料與方法

1．1 主要試劑與儀器

氯喹(Chloroquine，CQ),Bcl-2抑制劑ABT737，四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)均購自美國(guó)Sigma公司,RPMI 1640，胎牛血清購自美國(guó)Gibco公司。

1．2 細(xì)胞株與細(xì)胞培養(yǎng)

人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U343細(xì)胞購自中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所，培養(yǎng)于含 10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和40 U/ml慶大霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性

將U343細(xì)胞以5×103/ml密度接種于96孔板(每孔加200 μl)，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(24 h)，加入不同濃度藥物處理24 h后，小心吸去上清，加入90 μl新鮮培養(yǎng)液，再加入10 μl MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，棄上清，每孔加入100 μl二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。用酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(A)值。按下式計(jì)算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率 (%) = [A實(shí)驗(yàn)孔-A空白孔/(A對(duì)照孔-A空白孔)]×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3次。

1.4 western檢測(cè)蛋白表達(dá)

U343細(xì)胞經(jīng)藥物處理24 h后，加入細(xì)胞裂解液RIPA裂解，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。分離膠濃度12%，濃縮膠濃度5%，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，Cleaved PARP、Cleaved Caspase-3、細(xì)胞色素C(cytochrome c)抗體(Cell Signaling公司，1∶800)4℃孵育過夜，TBST洗3次膜，每次15 min，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗(Cell Signaling公司1∶5000)室溫孵育2 h，TBST洗3次膜，每次15 min，ECL顯影。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用 SPSS16．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以M±SD表示 ，均數(shù)差別顯著性檢驗(yàn)采用單因素方差分析，多組均數(shù)間比較采用最小顯著差數(shù)(LSD)法檢驗(yàn)，P<0．05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ABT737對(duì)U343細(xì)胞生存率的影響

U343細(xì)胞經(jīng)過10 μM、20 μM、30 μM ABT737處理24 h后，細(xì)胞生存率均顯著下降，并呈濃度依賴性(如圖1)。結(jié)果表明，ABT737具有降低U343細(xì)胞生存率的作用。

* 代表與對(duì)照組相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異

2.2 ABT737對(duì)U343細(xì)胞凋亡通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

western blot檢測(cè)U343細(xì)胞凋亡通路執(zhí)行蛋白caspase-3及其底物PARP，結(jié)果如圖2A和2B所示，與對(duì)照組相比Cleaved caspase-3和Cleaved PARP呈劑量依賴性的表達(dá)增加。另外，如圖2C所示cytochrome-c的表達(dá)量明顯增加，與空白對(duì)照相比較差異具有顯著性。以上結(jié)果表明ABT737可以激活凋亡通路，誘導(dǎo)U343細(xì)胞發(fā)生凋亡。

* 代表與對(duì)照組相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異

* 代表與對(duì)照組相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異

* 代表與對(duì)照組相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異

2.3 ABT737聯(lián)合應(yīng)用氯喹對(duì)U343細(xì)胞生存率的影響

為考察聯(lián)用氯喹對(duì)ABT737誘導(dǎo)凋亡的協(xié)同作用，首先應(yīng)用MTT法確定了氯喹對(duì)U343細(xì)胞的安全劑量，如圖3A所示，在20 μM劑量范圍內(nèi)，氯喹對(duì)細(xì)胞活性無顯著影響。然而，當(dāng)10 μM氯喹與20 μM ABT737共同作用24 h后，MTT結(jié)果如3B顯示，與對(duì)照組相比，二者單用均明顯降低U343細(xì)胞活性。二者聯(lián)用與單用ABT737組相比，細(xì)胞活性顯著降低。結(jié)果提示，氯喹和ABT737聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同作用，可更進(jìn)一步降低細(xì)胞生存率。

2.4 ABT737聯(lián)合應(yīng)用氯喹對(duì)U343細(xì)胞凋亡通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

western blot檢測(cè)結(jié)果如圖4A和4B所示，氯喹組與對(duì)照組相比，Cleaved caspase-3和Cleaved PARP表達(dá)水平?jīng)]有明顯改變。而氯喹與ABT737聯(lián)用組與單用ABT737組比較，Cleaved caspase-3和Cleaved PARP表達(dá)水平明顯增加。同樣，氯喹組的cytochrome-c表達(dá)水平與對(duì)照組相比無明顯改變，而氯喹與ABT737聯(lián)用組與單用ABT737組比較，cytochrome-c表達(dá)水平顯著增加(見圖4C)。結(jié)果表明，聯(lián)合應(yīng)用氯喹可以明顯增加ABT737引起的人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U343細(xì)胞凋亡。

圖3A 不同濃度氯喹對(duì)U343細(xì)胞生存率的影響

*與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，&與ABT737組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異

圖3BABT737聯(lián)合應(yīng)用氯喹對(duì)U343細(xì)胞生存率的影響

3 討論

對(duì)于惡性腫瘤細(xì)胞，細(xì)胞凋亡可以快速使細(xì)胞數(shù)量損失，而且可以導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)緩慢[10]。目前，諸多抗癌藥物的研發(fā)圍繞誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，當(dāng)“凋亡程序”受到破壞后，治療的敏感性降低[11]。而且研究發(fā)現(xiàn)，惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤的主要特點(diǎn)是對(duì)經(jīng)典的caspase依賴的凋亡途徑產(chǎn)生抵抗[12，13]。之前的研究發(fā)現(xiàn)ABT737可以誘導(dǎo)癌癥細(xì)胞凋亡[14]，在本研究中，我們同樣發(fā)現(xiàn)ABT737可以引起人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U343細(xì)胞發(fā)生線粒體通路介導(dǎo)的凋亡。

*與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，&與ABT737組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異

圖4AABT737聯(lián)合應(yīng)用氯喹對(duì)U343細(xì)胞CleavedPARP的影響

圖4B ABT737聯(lián)合應(yīng)用氯喹對(duì)U343細(xì)胞Cleaved caspase-3的影響

*與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，&與ABT737組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異

氯喹具有增加抗癌藥物敏感性的作用[15]，而且，正在進(jìn)行的臨床試驗(yàn)也提示氯喹可能會(huì)對(duì)現(xiàn)行的癌癥治療策略產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響[16]，本研究中我們發(fā)現(xiàn)聯(lián)合應(yīng)用氯喹可以明顯增加ABT737引起的人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U343細(xì)胞凋亡。但是，氯喹的毒性不容忽視。所以，本實(shí)驗(yàn)中通過MTT法選用了對(duì)癌細(xì)胞不產(chǎn)生顯著影響的劑量作為安全劑量，在此劑量下，氯喹表現(xiàn)出明顯的藥物協(xié)同作用。

綜上所述，小分子Bcl-2抑制劑ABT737聯(lián)合小劑量氯喹通過誘導(dǎo)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U343細(xì)胞凋亡顯著提高ABT737的化療敏感性,這為臨床治療癌癥及其他腫瘤提供了一種新的思路和方法，而氯喹發(fā)揮這種作用的具體分子機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

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