肝膽胰惡性腫瘤患者游離DNA的含量及完整性的研究

陳 芳, 謝 麗, 禹立霞, 劉寶瑞

(1. 南京醫科大學鼓樓臨床醫學院腫瘤中心暨南京大學臨床腫瘤研究所, 江蘇 南京, 210008;2. 安徽省馬鞍山十七冶醫院, 安徽 馬鞍山, 243000)

原發性肝細胞肝癌及胰腺癌的發病率占全部惡性腫瘤的第4及第7位，死亡率分別為第2位及第6位[1]。膽系惡性腫瘤發病率雖然沒有前兩種腫瘤高，但其預后差，5年生存率僅為2%～4%。這3種腫瘤因為發現時多為晚期，放化療不敏感，雖經過系統治療，預后仍不佳。目前，手術仍然是這3種腫瘤主要治療手段，所以早期診斷尤為重要。但因其解剖原因，目前的檢測手段不能滿足臨床需求。循環游離DNA能夠反映腫瘤組織的遺傳學及生物學特征，故又被稱作“液體組織活檢”[2], 以其無創可反復檢測而備受關注。本研究以肝、膽、胰腺惡性腫瘤患者為對象，對其外周血中游離DNA含量及完整性進行檢測及計算，探討其臨床價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

腫瘤組選擇2014年1—3月在南京市鼓樓醫院進行手術或穿刺取得病理證實為惡性腫瘤的患者共43例。其中男24例，女19例，年齡34～84歲，中位年齡57歲；原發性肝細胞患者15例，膽道系統腫瘤患者14例(包括肝內膽管細胞癌5例，肝外膽管癌4例，膽囊癌5例)，胰腺癌14例。對照組共40例，其中男22例，女18例，年齡26～74歲，中位年齡50.7歲。

1.2 試劑及儀器

天根生物科技(北京)有限公司的TIANamp Blood DNA kit(天根全血DNA提取試劑盒), AppLera公司生產的SYBR Green PCR Master Mix(2x), 美國Stratagene公司生產的MX 3000P Real Time PCR System熒光定量PCR儀，及國產紫外分光光度計。

1.3 引物

ALU115引物上游: 5-CCTGAGGTCAGGA

GTTCGAG-3; ALU115引物下游:5-CCCGAGTAGCTGGGATTACA-3; ALU247引物上游:5-GTGGCTCACGCCTGTTAATC-3; ALU 247引物下游: 5-CAGGCTGGAGTGCAGTGG-3。

1.4 實驗方法

1.4.1 標本的收集：收集術前肝、膽、胰腺惡性腫瘤患者外周靜脈血2 mL, EDTA抗凝。3 000 r/min離心15 min, 分離出400 μL血漿放入EP管中，-80 ℃冷凍保存。正常體檢患者血液處理同前。

1.4.2 外周血DNA的提取：按照TIANamp Blood DNA kit試劑盒說明書，抽提所有標本的血漿游離DNA標本，放入-20 ℃冰箱保存，以便統一熒光定量。

1.4.3 標準曲線的建立：以健康人外周血細胞總DNA作為陽性對照，用紫外分光光度計檢測含量3次，取平均值，并將其稀釋為20.0 ng/μL。后再按5倍梯度稀釋，含量分別為4.0 ng/μL、0.8 ng/μL、0.16 ng/μL、0.032 ng/μL、6.4 pg/μL。

1.4.4 PCR反應：采用實時熒光定量PCR進行分析，總反應體系為20 μL, 含2 μL DNA，10 μL SYBR Green PCR Master Mix，0.5 μL的二甲基亞砜和7.2 μL去離子水以及10 μmol/mL的引物上、下游各0.2 μL 。PCR擴增條件：95℃預變性10 min, 32個循環的95 ℃變性15 s, 60 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s。每批標本均同時設置標準曲線以便絕對定量，并以去離子水作為陰性對照。

1.5 數據處理

游離DNA的完整性=ALU247檢測的游離DNA含量/ALU115檢測的游離DNA含量。組間及組內比較采用非參數檢驗，診斷效能判斷使用ROC曲線分析。SPSS 17.0統計運算及雙尾檢驗，P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 惡性腫瘤患者組與對照組游離DNA含量及完整性比較

惡性腫瘤患者組短片段游離DNA含量中位數2.89 ng/μL(0.60～50.80ng/μL), 長片段游離DNA含量中位數為1.19 ng/μL (0.34～37.40 ng/μL), 均高于正常對照組0.85 ng/μL(0.49～9.11 ng/μL)及0.28 ng/μL(0.17～2.86 ng/μL), 2組有顯著差異(P<0.001)。而腫瘤組完整性0.37(0.15～0.95)相比于對照組0.33(0.08～0.67), 差異無統計學意義(P>0.05), 見表1。

表1 惡性腫瘤患者游離DNA含量及完整性與正常對照組的比較

與對照組比較，*P<0.05, **P<0.01。

2.2 3種腫瘤之間游離DNA含量與完整性的比較

原發性肝細胞肝癌組短片段游離DNA含量中位數2.34 ng/μL, 長片段總游離DNA含量1.12 ng/μL, 完整性0.41; 膽道惡性腫瘤組為3.42 ng/μL, 1.225 ng/μL, 0.28; 胰腺癌組分別4.015 ng/μL, 1.16 ng/μL, 0.28。三種腫瘤在總游離DNA含量及長片段游離DNA含量上無明顯差異，而完整性則有明顯差異(P=0.033)。其中原發性肝細胞組完整性較對照組高(P=0.022), 而其他兩種腫瘤與對照組相比未見差異，見表1。

2.3 惡性患者游離DNA含量及完整性與各臨床資料的關系

血漿游離DNA含量及完整性與性別、年齡(≤60歲與>60歲組間)、腫瘤大小(5 cm為界)、神經脈管是否受侵、腫瘤分期無顯著差異(P>0.05)，見表2。

表2 腫瘤患者游離DNA含量及完整性與臨床指標間的關系

2.4 游離DNA含量與完整性對惡性腫瘤的診斷價值

以ALU115、ALU247為引物測得的游離DNA含量及其完整性制作ROC曲線。其中ALU115片段ROC曲線下的面積(AUC)為0.80，95%的可信區間(CI)為0.71～0.89(P<0.001)。選擇其最佳截斷濃度為2.21 ng/μL, 靈敏度60%, 特異度86.05%。而以長片段ALU247為引物AUC為0.85, 95% CI為0.77～0.93(P<0.001)。其最佳截斷濃度1.92 ng/μL時，此時靈敏度和特異度分別90%和62.79%。以完整性AUC僅為0.56，95% CI為0.44～0.69(P=0.327)。完整性在惡性腫瘤組及對照組無明顯差別，不能作為診斷依據。

3 討 論

眾所周知，病理診斷是腫瘤診斷的“金標準”，但肝、膽、胰腺由于其解剖位置的原因，許多腫瘤患者術前未能明確病理，多以影像學檢查聯合相關腫瘤指標(CEA、AFP、CA199等)臨床診斷。但其靈敏度及特異性差，存在一定的誤診誤治的情況。且局部穿刺活檢，取得少量組織病理，一方面給患者帶來巨大痛苦，不利于長期的隨訪監測；另一方面也很難反映腫瘤總體性狀。臨床上需要一種能夠提供早期診斷、高效、微創、靈敏度及特異性高的診斷方法。外周血游離DNA從1948年被發現至今[3]，經歷70多年的歷史，尤其是近20年，人們從外周血DNA中發現與腫瘤組織相同的遺傳性狀[4]，認為其有望代替現有的檢測手段用于臨床的腫瘤診斷及療效評估。 近些年，游離DNA的檢測多采用實時熒光定量PCR(RTFQ-PCR)檢測辦法，該辦法在以往的PCR反應的基礎上加入熒光基團，利用熒光信號的強弱對PCR反應實時監測，并通過建立標準曲線對未知模板進行絕對定量。而ALU是人類基因組中最常見的重復序列，總長300 bp左右，共占人類基因組的5%～10%, 只要有合適的引物就能對ALU序列進行擴增。兩項結合極大提高檢測的敏感性，甚至能檢測0.1 μL的血液標本[5]。

本實驗利用ALU115及ALU247作為引物，建立了相應的標準曲線，分別對腫瘤患者及正常人血漿中的游離DNA進行RTFQ PCR檢測，并計算出其完整性及與臨床數據進行一些針對性的比較。得出結論示，惡性腫瘤患者血中ALU115片段含量及ALU247片段含量與正常體檢者存在明顯差異(P<0.001)。且ALU247片段含量在診斷上更加敏感，ROC曲線面積達到0.85，考慮與游離DNA的來源有一定的關系。雖然游離DNA的真正來源尚不明確，但大多數學者[6]認為正常人血中游離DNA來源于細胞的凋亡，而腫瘤患者血中的游離DNA除了來源于細胞凋亡外，還來源于腫瘤細胞的壞死，腫瘤組織[7]及血中循環腫瘤細胞的釋放。所以腫瘤患者體內的血中游離DNA的含量及長片段DNA的含量較正常人都更加豐富。Umetani等[8]使用ALU115及247片段擴增乳腺癌及正常患者血中游離DNA，發現在早在Ⅱ期患者血中游離DNA含量顯著高于正常(P=0.005)。本實驗Ⅰ～Ⅱ期患者血中總游離DNA含量及長片段游離DNA含量為2.70 ng/μL、1.18 ng/μL, 與正常對照組相比有顯著差異(P=0.002), 與Umetani的結論一致。考慮與腫瘤早期，細胞增殖較快，大量游離DNA釋放入血，與正常對照組有明顯區別，敏感性高，對于腫瘤的早期診斷有一定指導意義。另有報道[9]游離DNA含量在各腫瘤類型之間存在區別，如同樣使用ALU115為引物，腸癌組患者AUC面積0.75，而壺腹部癌AUC面積僅0.59, 對于診斷的價值有明顯差異。故本研究又把3種腫瘤分開與正常對照組比較。結果顯示, ALU115片段含量及ALU247片段含量在肝膽胰患者與正常對照組之間雖然仍然有差異。但ALU115片段在原發性肝細胞肝癌診斷價值上(0.013)不如膽系惡性腫瘤及胰腺癌敏感(P<0.001)[10]。

本研究結果顯示，游離DNA的總量及長片段的含量與患者的年齡、性別、腫瘤大小、神經受侵、脈管受侵、分期之間均無明顯差異。但有關于乳腺癌的研究[5]指出，游離DNA的含量與腫瘤大小相關。同樣見于原發性肝細胞肝癌的研究[11-12], 認為腫瘤>5 cm組與≤5 cm組有顯著差異(P<0.01), 且在Ⅰ～Ⅱ期患者與Ⅲ～Ⅳ期中有差別(P=0.01)。而本研究并未見相關性，后續可考慮增加樣本量進一步研究。本研究結果所示，游離DNA的完整性僅在原發性肝細胞肝癌的診斷上有意義(P=0.022)。而其他數據游離DNA的完整性均無統計學意義。

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