溫膽湯對脂質代謝紊亂相關基因Adiponectin和LDLR甲基化的影響*

★ 楊海燕 王萍*

(江西中醫藥大學 江西 南昌 330006)

溫膽湯是中醫治療痰證的名方，臨床上用于治療肥胖及相關疾病具有較好療效[1]。以DNA甲基化為代表的表觀遺傳學機制參與了肥胖、心血管疾病、糖尿病、腫瘤等許多復雜疾病的形成和發展[2]。中醫是否可以通過干預DNA甲基化狀態達到調整機體的作用是很值得探討的問題。脂聯素(Adiponectin)和低密度脂蛋白受體(low density lipoprotein receptor, LDLR)均參與脂質代謝，與肥胖及相關疾病的形成有很大關聯。本研究即探討溫膽湯對脂聯素和低密度脂蛋白受體啟動子甲基化狀態的影響。

1 材料與方法

1.1 大鼠肥胖模型制作 選擇SPF級SD雄性大鼠50只，體重(60±10)g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SCXK(湘)2013-0004。大鼠隨機分為兩組，即高脂飼料喂養組(簡稱高脂組)和基礎飼料喂養組(簡稱正常組)，其中高脂組30只，正常組20只。高脂組大鼠從購入起即進行高脂飼料喂養。高脂飼料由100g基礎飼料中加入豬油15g、蛋黃粉10g、全脂奶粉15g、豬膽鹽0.5及濃縮魚肝油適量組成[3]。各組大鼠分別喂養4周后，淘汰體重過大或過小的大鼠，其中高脂組納入20只，正常組納入10只。高脂組入選大鼠的體重要符合肥胖模型的標準[4]。

1.2 藥物干預 上述大鼠肥胖模型制作成功后，高脂組大鼠隨機分為兩組，每組10只，兩組均停止高脂飼料喂養，采用基礎飼料繼續喂飼。其中一組高脂組大鼠用溫膽湯灌胃干預1個月(溫膽湯組)，另一組采用飲用水灌胃(模型對照組)。另有正常組10只，也采用飲用水灌胃(正常對照組)。溫膽湯(陳皮10g、法半夏10g、茯苓10g、竹茹10g、炒枳實6g、炙甘草3g、生姜3g、大棗5g)各組成藥物以中藥配方顆粒劑進行配置，由廣東一方制藥有限公司生產。臨用時把各顆粒劑放入容器中，加熱水溶解，制成1g/mL生藥濃度。溫膽湯劑量采用人臨床生藥折算劑量5.5g/kg的2倍劑量11g/kg。

1.3 DNA提取 溫膽湯干預1個月后，分別處死3組大鼠，獲取腎周脂肪組織提取DNA。DNA提取采用高脂肪組織基因組DNA提取試劑盒(Solar-bti)，提取步驟按照試劑盒說明書進行。

1.4 DNA甲基化特異性PCR檢測 DNA進行純度檢測合格后，采用EZ DNA Methylation-Gold Kit試劑盒進行亞硫酸氫鈉修飾。然后進行PCR反應與瓊脂糖電泳。DNA甲基化PCR引物設計采用urogene網站在線設計優化。

脂聯素(Adiponectin)甲基化引物參數為：Left M primer，Start 1798，Size 25，Tm 59.11，GC% 56.00，'C's 5，Sequence TAAAGGTAGGATTTAGGTTTTGTGC；Right M primer，Start 2009，Size 24，Tm 58.61，GC% 54.17，'C's 4，Sequence CTTAAAAACCTCTCAACAAACTCG；Product size:212, Tm:68.9。

Left U primer，Start 1799, Size 25, Tm 59.00, GC% 60.00,'C's 5,Sequence AAAGGTAGGATTTAGGTTTTGTGTG；Right U primer，Start 2009，Size 25，Tm 57.74，GC% 56.00，'C's 4，Sequence CTTAAAAACCTCTCAACAAACTCAC；Product size:211, Tm:68.1。

低密度脂蛋白受體(LDLR)甲基化引物參數為：Left M primer，Start 660，Size 23，Tm 59.72，GC% 65.22，'C's 5，Sequence TTGTTAAGCGAGGGAGTTGTTAC；Right M primer，Start 849，Size 25，Tm 57.64，GC% 52.00，'C's7，Sequence ACCAAAATTCAATATCAAATATTCG； Product size:190,Tm:59.6。

Left U primer，Start 660，Size 25，Tm 58.27，GC% 64.00，'C's 5，Sequence TTGTTAAGTGAGGGAGTTGTTATGT；Right U primer，Start 847，Size 25，Tm 56.03， GC% 52.00，'C's 6，Sequence CAAAATTCAATATCAAATATTCACC；Product size:188,Tm:59.5。

1.5 統計學方法 計數資料采用IBM SPSS statistics 19統計軟件進行卡方檢驗。

2 結果

2.1 DNA質量檢測結果 樣本的DNA純度較好，可以滿足甲基化PCR的要求。DNA純度判斷標準：OD260/OD280≈1.8(>1.9,表明有RNA污染；<1.6，表明有蛋白質、酚等污染)。

2.2 脂聯素啟動子甲基化PCR結果 分別比較溫膽湯組、模型對照組和正常對照組間腎周脂肪組織脂聯素啟動子的甲基化狀態。結果顯示，大鼠腎周脂肪脂聯素基因存在著三種甲基化狀態，即甲基化(M+,U-)、未甲基化(M-,U+)和不完全甲基化(M+,U+)。其中溫膽湯組甲基化3例，非甲基化4例和不完全甲基化3例；模型對照組甲基化5例，非甲基化2例，不完全甲基化3例；正常對照組甲基化2例，非甲基化6例，不完全甲基化2例，見表1。若把甲基化和不完全甲基化同歸為可能的甲基化狀態，則溫膽湯組甲基化狀態為6例，模型對照組甲基化狀態為8例，正常對照組甲基化狀態為4例，見表2。采用卡方檢驗的fisher精確法檢測結果顯示，三組間均無統計學差異(P﹥0.05)。

表1 脂聯素基因啟動子甲基化結果

表2 三組間脂聯素基因啟動子甲基化的比較

2.3 大鼠LDLR啟動子區經預測無CpG島，考慮到人的LDLR啟動子區有CpG島，仍以urogene網站推薦基因甲基化PCR引物進行嘗試研究，未能獲得可信結果。

3 討論

表觀遺傳學認為，基因啟動子區的甲基化可能導致基因的表達受抑制[5]。本研究結果顯示，高脂飲食導致的大鼠肥胖模型中，與代謝紊亂有關的基因(如脂聯素)可能存在著啟動子甲基化狀態的改變。也就是說，高脂肥胖大鼠模型可能與調節代謝的基因表達改變有關。本研究結果即表明，脂聯素在高脂模型中存在著啟動子區甲基化的趨勢，盡管從統計學上并無顯著性差異，但這一趨勢值得進一步探索。溫膽湯作為中醫治療痰證的名方，對改善脂質代謝紊亂的肥胖具有較好的療效。本研究發現，溫膽湯可能可以逆轉高脂飲食導致的脂聯素基因啟動子區甲基化的狀態，這也可能是其發揮療效的作用點。大鼠LDLR的啟動子區雖然沒有發現CpG島，甲基化的可能性較小。但啟動子區有時并不僅僅存在于轉錄基因之前的序列，也會存在轉錄序列之間。所以，高脂飲食導致的肥胖模型是否伴隨著啟動子區等序列的甲基化狀態改變，還需要深入研究。更應該注意的是，人類的LDLR啟動子區是存在著CpG島的，這就需要在臨床研究中去探討此類問題。

現代研究發現，包括脂聯素和低密度脂蛋白受體等在內的諸多基因的甲基化狀態改變，與疾病的發生發展有著密切關聯。如在一項針對動脈粥樣硬化患者的研究中發現，AS患者存在著低密度脂蛋白受體的甲基化[6]。而肥胖對孕婦的脂聯素基因的甲基化模式也有影響[7]。

中醫的病證發生發展可能與表觀遺傳學等機制有關聯[8]，而中醫藥干預疾病的機制多樣，對表觀遺傳學機制的影響也可能是其中一環。但目前這方面的研究報道不多，是值得關注的領域。

[1]連東輝.加味溫膽湯治療痰濕壅盛型肥胖性高血壓病60例[J].河南中醫,2012,32(7):913-914.

[2]張林,胡茂清.表觀遺傳和肥胖[J].中國糖尿病雜志,2013,21(4):376-378.

[3]王磊,陳虹.幼年雄性SD大鼠營養性肥胖模型的建立[J].中國藥業,2010,19(17):6-7.

[4]Chandler PC, Viana JB, Oswald KD, et al.Feeding response to melanocortin agonist predicts preference for and obesity from a high-fat diet[J].Physiol Behav，2005,85(2):221-230.

[5]史玉杰,李慶賀,劉曉輝.DNA甲基化與基因表達調控研究進展[J].中國生物工程雜志,2013,33(7):90-96.

[6]智艷芳,黃彥生,李著華,等.動脈粥樣硬化病人LDL受體基因啟動子序列的高甲基化改變[J].分子細胞生物學報,2007,40(6):419-427.

[7]Haghiac M, Basu S, Presley L，et al.Patterns of Adiponectin Expression in Term pregnancy: Impact of Obesity[J].J Clin Endocrinol Metab，2014, 99(9): 3 427-3 434.

[8]王萍,楊海燕,王麗萍,等.從表觀遺傳學開展復雜性疾病證候本質的研究[J].中華中醫藥雜志,2011,26(5):1 208-1 210.