過表達KLF4對棕櫚酸所致L6骨骼肌細胞胰島素抵抗的影響

張哲 王超

·論著·

過表達KLF4對棕櫚酸所致L6骨骼肌細胞胰島素抵抗的影響

張哲 王超

目的 探討Krüppel樣因子4 (KLF4)過表達對大鼠L6骨骼肌細胞胰島素抵抗的影響。方法采用棕櫚酸誘導法建立大鼠L6骨骼肌細胞的胰島素抵抗模型，隨機分為對照組和轉染組。對照組轉染腺病毒空載體(Ad)，轉染組轉染KLF4腺病毒表達載體(Ad-KLF4)。采用Real-time PCR和Western-blot檢測兩組KLF4、胰島素受體(IR)和葡萄糖轉運蛋白4(GLUT4)的表達水平，采用葡萄糖氧化酶法檢測兩組培養液中的葡萄糖濃度。結果與對照組比較，棕櫚酸誘導組對葡萄糖的攝取量顯著降低(P<0.05)，KLF4、IR、GLUT4表達顯著下調(P<0.05)。KLF4過表達可顯著提高細胞對胰島素的敏感性，并上調IR、GLUT4表達。結論過表達KLF4可導致IR、GLUT4表達上調，并改善骨骼肌細胞的胰島素抵抗。

Krüppel樣因子4;基因轉染;骨骼肌細胞;胰島素抵抗

胰島素抵抗是機體靶組織(骨骼肌、肝臟、脂肪)對胰島素敏感性降低的一種病理狀態，長期胰島素抵抗與糖尿病、肥胖及高血壓等心血管疾病的發病密切相關，而骨骼肌是胰島素刺激下機體攝取并利用葡萄糖的主要靶器官[1]。Krüppel樣因子4 (Krüppel-like factor 4，KLF4)是一種鋅指蛋白轉錄因子，在細胞增殖、分化、血管形成、腫瘤發生發展中發揮廣泛的調控作用[2]。Aktug等[3]采用免疫組織化學方法證實，KLF4在STZ誘導的Ⅰ型糖尿病大鼠睪丸組織表達下調，提示KLF4與糖尿病的病理過程有關。然而，KLF4在骨骼肌胰島素抵抗中的作用目前尚未見報道。本實驗采用L6骨骼肌細胞株，通過棕櫚酸誘導造成胰島素抵抗模型，旨在觀察KLF4過表達對胰島素抵抗的影響，為研究胰島素抵抗的分子機制提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 L6細胞株(中國協和醫科大學細胞中心)；α-MEM、胎牛血清(FBS)、牛血清白蛋白(BSA)、胰蛋白酶(美國GIBCO公司)；葡萄糖氧化酶試劑盒(上海生工生物工程技術服務有限公司)；多克隆抗體(美國Sigma公司)。Lipofectamin 2000、RT-PCR相關試劑(美國Promega公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養、胰島素抵抗模型的建立和鑒定5% CO2、37℃飽和濕度條件下,將復蘇后的大鼠L6肌細胞接種在含10%FBS、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的α-MEM培養基中培養。2 d后更換含2% FBS的α-MEM培養基進行誘導培養，每天換液1次，直至細胞長出肌管。細胞消化后轉入24孔板(1×106個/孔)，隨機分為對照組和誘導組。對照組加入正常α-MEM培養基，誘導組加入含0.3 mmol/L棕櫚酸的α-MEM培養基，培養24 h。兩組細胞用預冷PBS洗滌2次，先加入含100 ng/ml胰島素的正常培養基孵育30 min，再加入5.6 mmol/L葡萄糖孵育24 h。采用葡萄糖氧化酶法測定細胞上清液中葡萄糖濃度。

1.2.2 重組腺病毒轉染將大鼠全長KLF4 cDNA序列克隆到腺病毒表達載體pAd/CMV/V5-DEST中。酶切和測序鑒定后，將空載體病毒及重組腺病毒利用Lipofectamin 2000脂質體轉染A293細胞，包裝、擴增后得到重組腺病毒質粒Ad-KLF4。轉染24 h后反復凍融裂解細胞收集上清液，G418篩選陽性克隆并培養14 d。誘導組細胞隨機分為空載體對照組(Ad)和轉染組(Ad-KLF4)，繼續培養48 h用于病毒感染。

1.2.3 Real-time PCR：根據GeneBank中大鼠KLF4、IR、GLUT4 mRNA序列，采用DNAMAN軟件設計引物，引物序列見表1，由上海生物工程技術服務有限公司合成。Trizol提取各組細胞總RNA,用紫外分光光度計鑒定RNA的純度并定量。參考逆轉錄試劑盒說明書操作合成cDNA第1鏈。PCR 反應采用ABI 7300型熒光定量PCR儀。目的基因相對表達量RQ =2-△△Ct，設GAPDH為內參照基因。

表1 KLF4、IR、GLUT4、GAPDH引物序列及擴增產物長度

1.2.4 Western-blot各組細胞培養48 h后提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。蛋白樣品按4∶1體積比加入5×上樣緩沖液內混勻，100℃煮沸5 min變性。將100 μg總蛋白進行10% SDS-PAGE，電轉移至PVDF膜上，10%脫脂奶粉封閉2 h。用特異性一抗(1∶2 000) 4℃孵育過夜，TBST洗膜后加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG(1∶5 000)室溫孵育1 h,洗膜后ECL化學發光法顯色、定影。用UVP軟件分析，檢測蛋白條帶IOD值。

2 結果

2.1 對照組和誘導組葡萄糖代謝水平的比較 葡萄糖消耗實驗結果顯示，誘導組細胞上清液中葡萄糖濃度(13.09±2.52)mmol/L與對照組(3.74±0.12)mmol/L比較顯著增加(P<0.05)，提示棕櫚酸誘導L6肌細胞IR模型建立成功。

2.2 對照組和誘導組KLF4、IR、GLUT4表達的比較 以GAPDH為內參照，Real-time PCR和Western-blot結果顯示，誘導組KLF4/GAPDH、IR/GAPDH、GLUT4/GAPDH mRNA相對表達水平與對照組比較,差異有統計學意義(P<0.05)。見表2，圖1。

組別KLF4/GAPDHmRNA相對表達水平IR/GAPDHmRNA相對表達水平GLUT4/GAPDHmRNA相對表達水平對照組0．81±0．330．88±0．360．75±0．28誘導組0．32±0．08?0．47±0．16?0．42±0．11?

注：與對照組比較，*P<0.05

圖1 棕櫚酸刺激對KLF4、IR、GLU4蛋白表達的影響

2.3 Ad-KLF4轉染L6肌細胞對IR、GLUT4表達和葡萄糖代謝的影響 結果顯示，轉染L6肌細胞48 h后， Ad-KLF4組 KLF4/GAPDH mRNA、IR/GAPDH mRNA和GLUT4/GAPDH相對表達水平與Ad組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。細胞對葡萄糖的代謝能力亦明顯改善，Ad-KLF4組細胞上清液中葡萄糖濃度(7.6±1.3)mmol/L與空載體對照組(13.2±2.7)mmol/L比較顯著降低(P<0.05)。見表3，圖2。

組別KLF4/GAPDHmRNA相對表達水平IR/GAPDHmRNA相對表達水平GLUT4/GAPDHmRNA相對表達水平Ad組0．30±0．060．43±0．130．39±0．08Ad?KLF4組0．72±0．31?0．65±0．24?0．62±0．18?

注：與Ad組比較，*P<0.05

3 討論

胰島素抵抗是周圍組織對胰島素敏感性降低，胰島素刺激下葡萄糖的利用率下降，導致糖脂代謝紊亂的一種病理狀態。胰島素抵抗形成機制的研究對糖尿病的預防和治療具有重要意義。而體內葡萄糖主要被骨骼肌組織攝取和利用，骨骼肌對葡萄糖的轉運障礙是Ⅱ型糖尿病胰島素抵抗的重要原因。

圖2 過表達KLF4對IR、GLUT4蛋白表達和葡萄糖代謝水平的影響

KLF4是一種具有結合位點特異性的鋅指結構轉錄因子，其羧基端含有3個連續且高度保守的鋅指結構(CX2-4CX3FX5LX2HX3H)，此為該家族的典型結構特征。KLF4通過與p53、細胞周期蛋白D1等下游基因啟動子區的結合元件結合調控目的基因的轉錄，在細胞增殖、分化和凋亡過程中發揮廣泛的調控作用。迄今研究發現，KLF4與腫瘤發生、皮膚屏障形成、睪丸發育等生理、病理過程密切相關[4]。

2013年，Aktug等[3]研究提出在Ⅰ型糖尿病大鼠睪丸組織石蠟切片中KLF4表達水平明顯降低，提示KLF4參與了糖尿病的病理過程。然而，KLF4對骨骼肌胰島素抵抗的影響目前尚未見報道。為了闡明KLF4在骨骼肌胰島素抵抗中的作用，我們建立了L6骨骼肌細胞胰島素抵抗模型。Real-time PCR和Western-blot方法證實，誘導組細胞KLF4、IR、GLUT4表達顯著下調，且細胞對葡萄糖的攝取量顯著降低。進而，

我們利用腺病毒表達載體將外源KLF4基因成功導入L6細胞，使之在細胞中高效表達。我們發現過表達KLF4可明顯上調IR、GLUT4的表達并改善骨骼肌細胞的胰島素抵抗，提示 KLF4參與了骨骼肌胰島素抵抗的發生發展。

目前，KLF4在細胞內的信號調節機制尚未完全闡明。多項研究表明，KLF4和p300相互作用造成KLF4乙酰化后通過增強腸堿性磷酸酶、p21、Mfn2啟動子活性促進這些基因的轉錄和表達[5,6]。在骨骼肌細胞，KLF4是否通過上述機制調控胰島素抵抗過程還有待于進一步研究。總之，本研究首次提出KLF4對骨骼肌胰島素抵抗產生負性調控作用，KLF4可能通過上調IR、GLUT4的表達減輕骨骼肌胰島素抵抗。研究KLF4在骨骼肌胰島素抵抗中的作用有助于闡明疾病發生的分子機制，從而對疾病的防治提供潛在的治療靶點。

1 Lipina C,Macrae K,Suhm T,et al.Mitochondrial substrate availability and its role in lipid-induced insulin resistance and proinflammatorysignalingin skeletal muscle.Diabetes,2013，62：3426-3436.

2 Lin ZS,Chu HC,Yen YC,et al.Krüppel-like factor 4,a tumor suppressor in hepatocellular carcinoma cells reverts epithelial mesenchymal transition by suppressing slug expression.PLoS One,2012,7：43593.

3 Aktug H,Uysal A,Yavasoglu A,et al.The detrimental effects ofdiabeteson pluripotency determined byKLF4,SOX2,C-MYC and OCT4 immunoreactivity in rat testes.Adv Clin Exp Med,2013,22:327-335.

4 Evans PM,Liu C.Roles of Krüpel-like factor 4 in normal homeostasis,cancer and stem cells.ActaBiochimBiophys Sin,2008,40:554-564.

5 Rui ZH,Mei HA,Bin ZH,et al.Krüppel-like factor 4 interacts with p300 to activate mitofusin 2 gene expression induced by all-transretinoic acid in VSMCs.ActaPharmacologica Sinica,2010,31:1293-1302.

6 Evans PM,Zhang W,Chen X,et al.Krüppel-like factor 4 is acetylated by p300 and regulates gene transcription via modulation of histone acetylation.J Biol Chem,2007,282:33994-34002.

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計量資料中有效數字的確定

本刊編輯部

EffectofKLF4overexpressiononpalmitate-inducedinsulinresistanceinL6skeletonmusclecellsofrats

ZHANGZhe,WANGChao.KeyLaboratoryaboutGeriatricMedicine,HebeiProvincialPeople’sHospital,Shijiazhuang050051,China

ObjectiveTo investigate the effect of Krüppel-like factor 4 (KLF4) overexpression on palmitate-induced insulin resistance in L6 skeleton muscle cells of rats.MethodsThe insulin resistance models in L6 skeleton muscle cells of rats were induced by palmitic acid,which were randomly divided into two groups,control group and experiment group.The differentiated L6 skeleton muscle cells in control group were transfected with adenovirus empty vector (Ad),however,which in experiment group were transfected with KLF4 adenovirus expression vector (Ad-KLF4).The expression levels of KLF4,insulin receptor (IR) and glucose transporter type 4 (GLUT4) in both groups were detected by Real-time PCR and Western Blot.ResultsAs compared to those in control group,the expression levels of KLF4,IR and GLUT4 in experiment group were significantly down-regulated (P<0.05),and the intaking amount for glucose was obviously decreased (P<0.05).The overexpression of KLF4 could enhance the sensitivities of the cells to insulin,and could up-regulate the expression levels of IR and GLUT4.ConclusionKLF4 overexpression can up-regulate the expression levels of IR and GLUT4,and can improve insulin sensitivities of L6 cells effectively.

Krüppel-like factor 4;gene transfection;skeletal muscle cell;insulin resistance

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.02.001

項目來源：河北省自然科學基金(編號：C2011307008)

050051 河北省石家莊市，河北省人民醫院省老年醫學重點實驗室

王超，050051 河北省石家莊市，河北省人民醫院省老年醫學重點實驗室；

E-mail：13731156811@163.com

R 347.8

A

1002-7386(2014)02-0165-03

203-08-07)