丹參酮ⅡA對壓力負荷增加大鼠心肌NF-κB表達的影響

蔡輝 蔡佳宇 常文靜 趙智明 董曉蕾 趙凌杰

·論著·

丹參酮ⅡA對壓力負荷增加大鼠心肌NF-κB表達的影響

蔡輝 蔡佳宇 常文靜 趙智明 董曉蕾 趙凌杰

目的 觀察丹參酮ⅡA(Tanshinone ⅡA，TanⅡA)對壓力負荷增加大鼠心肌組織核因子-κB(NF-κB)表達的影響，并探討其對心肌纖維化的保護作用。方法采用腹主動脈縮窄術制備壓力負荷心肌纖維化模型，術后存活32只大鼠隨機分成4組(n=8)，假手術組、模型組、TanⅡA組(20 mg·kg-1·d-1)及陽性對照藥物卡托普利組(100 mg·kg-1·d-1)。術后4周成功造模并開始給藥，療程為4周。8周后檢測左心室重量指數、心肌組織病理學、心肌羥脯氨酸含量以及心肌組織NF-κB p65 蛋白含量。結果與假手術組比較，模型組大鼠心室治療指數和左心室質量指數明顯升高(P< 0.01)；與模型組比較，TanⅡA則顯著降低(P<0.01)。與假手術組比較，模型組大鼠心肌羥脯氨酸含量明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，TanⅡA組則顯著降低(P<0.01)。與假手術組比較，模型組大鼠心肌組織NF-κB p65 表達顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，TanⅡA組則顯著降低(P<0.01)。結論TanⅡA能抑制心肌肥厚，減輕心肌纖維化，此作用可能與部分下調NF-κB表達有關。

丹參酮ⅡA；壓力負荷；心肌纖維化； 核因子-κB

壓力負荷增加能激發心肌短暫的炎性反應，誘導促炎細胞因子表達，介導心肌纖維化[1]。NF-κB作為一種核轉錄因子，可誘導細胞因子、趨化因子和基質金屬蛋白酶的轉錄，進一步促進炎癥和纖維化反應，參與心室重構的進展[2]。丹參酮ⅡA作為傳統中藥丹參的脂溶性有效成分，已被廣泛應用于臨床治療心血管疾病。研究證明，丹參酮ⅡA能有效地抑制大鼠心臟成纖維細胞增殖和表型轉化，減少細胞外基質產生，延緩心肌纖維化[3，4]，但其具體作用機制仍需進一步闡明。本研究通過建立腹主動脈縮窄術制備壓力負荷增加心肌纖維化模型，在體觀察NF-κB p65蛋白在壓力負荷增加大鼠心肌中的表達，以及丹參酮ⅡA對壓力負荷增加大鼠心肌纖維化的影響，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級6周齡SD大鼠60只，雄性，體重160～200 g [許可證號：SYXK(蘇)2003-0032]，由南京軍區南京總醫院動物實驗中心提供。動物飼養室溫為(23±3)℃，周期光照8∶00～20∶00，飼料、墊料高壓滅菌，常規飼料喂養，自由進食、飲水。

1.2 藥品與試劑 丹參酮Ⅱ A磺酸鈉注射劑，2 ml∶10 mg，上海第一生化藥業有限公司生產；卡托普利片，12.5 mg/片，中美上海施貴寶制藥有限公司；羥脯氨酸測定試劑盒，南京凱基生物科技發展有限公司；NF-κB p65一抗，武漢博士德有限公司；DAB 顯色劑、MaxvisionTM購自福州邁新生物技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 心肌纖維化模型制備：采用Anversa等[5]所用方法用腹主動脈縮窄術制備壓力負荷心肌纖維化模型。大鼠適應性喂養5 d后，術前禁食12 h，自由飲水，將手術組用10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)行腹腔注射麻醉，固定，剃毛，常規備皮消毒后，于劍突下沿腹正中線逐層開腹，在腎動脈上方分離腹主動脈，在腎動脈上方0.5 cm用內徑0.70 mm銀夾夾閉，使腹主動脈縮窄60%～70%，確認無出血，將臟器復位后逐層關閉腹腔，術后給予青霉素10萬U/kg肌內注射抗感染3 d，6 h后恢復飲食。假手術組不結扎腹主動脈，余處理同上，術后觀察4周。造模成功標準為：大鼠的心臟質量指數(HWI=HW/BW)和左心室質量指數(LVWI=LVW/BW)均明顯升高。

1.3.2 給藥及分組：取術后存活大鼠32只隨機分4組，每組8只：假手術組、模型組(10 mg·kg-1·d-1，腹腔注射)、丹參酮ⅡA組(20 mg·kg-1·d-1，腹腔注射)及卡托普利組(100 mg·kg-1·d-1，灌胃)。4組每天上午給藥1次，連續給藥4周，觀察大鼠的飲食、毛色、活動、水腫等一般性狀，每周稱體重(BW)。

1.3.3 心臟質量指數和左心室質量指數測定：術后8周末，禁食12 h，將5組大鼠稱重后采用10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)行腹腔注射麻醉，取血完畢后，迅速開胸摘取心臟，于4℃ 0.9%氯化鈉溶液中洗去血液，濾紙吸干，除去心臟周圍組織和大血管，稱取心臟重量(HW)，再剪去左右心房、右心室游離壁保留左心室及室間隔，稱取左心室重量(LVW)。分別計算心臟重量指數(HWI=HW/BW)和左心室重量指數(LVWI=LVW/BW)，以HWI和LVWI作為判斷心肌肥厚的指標。透壁剪取左心室心尖部分組織投入液氮中留待檢測其他指標，其余標本放于4℃的4%多聚甲醛中固定。

1.3.4 病理形態學檢測：心肌標本于甲醛中固定24 h后，常規取材、脫水、石蠟包埋，沿左室長軸線每隔1 mm橫斷面切取數張4 μm厚的切片，作HE和Masson染色。光學顯微鏡觀察心肌組織形態學改變及膠原沉積情況。

1.3.5 大鼠心肌組織羥脯氨酸(hydroxyproline，HYP)檢測：心肌組織中HYP的含量可用于估測心肌組織中的膠原水平，即心肌纖維化程度。采用化學比色法測定大鼠心肌組織中HYP含量，嚴格按照試劑盒說明書操作，心肌組織蛋白定量采用改良Lowry’s法。

1.3.6 Maxvision免疫組化染色：石蠟切片常規脫蠟至水，高溫高壓抗原修復，噴氣后計時2 min，自然冷卻，水洗，用PBS沖洗1次，1 min，除去PBS，每張切片滴加50 μl 3% H2O2溶液，室溫下孵育10 min，PBS 沖洗3 次，每次1 min，除去PBS，每張切片滴加50 μl一抗NF-κB p65，37℃孵育1 h，每次1 min，除去PBS，滴加50 μl辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫下孵育10 min；PBS沖洗3次，每次1 min，除去PBS，滴加50 μl MaxvisionTM試劑，室溫下孵育10 min；PBS沖洗3次，每次1 min，除去PBS，滴加50 ul新鮮配制的顯色劑(DAB)，室溫下孵育10 min；自來水沖洗，蘇木素復染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。DAB顯色陽性表達為棕色。每份標本隨機選取5 個高倍視野(×400倍)，采用Image-pro Plus Version 6.0軟件進行圖像分析，結果以平均光密度(MD)表示。

2 結果

2.1 大鼠一般狀態 術前60只大鼠，50只大鼠進行腹主動脈縮窄術，造模4周時，手術組大鼠有18只死亡，主要死因為嚴重心力衰竭，至實驗結束時，未再出現大鼠死亡。隨機選取24只分為3組(n=8)：模型組、丹參酮ⅡA組和卡托普利組。假手術組存活10只，隨機選取8只。術后第1周4組動物均精神萎靡，活動量減少，毛色暗淡，攝食及飲水減少，1周后好轉。整個實驗期間，假手術組大鼠一般狀況良好，對外界刺激反應靈敏，行動敏捷，毛色光澤，攝食及飲水正常，與術前未見明顯差別；模型組大鼠后期精神萎靡，行動遲緩，倦臥，毛色逐漸失去光澤；而丹參酮ⅡA組和卡托普利組大鼠的一般狀況較模型組明顯好轉。4組大鼠均未出現呼吸困難、水腫、進食困難、尿少等心力衰竭癥狀。

2.2 HWI和LVWI結果 與假手術組比較，模型組的HWI和LVWI均顯著增大(P< 0.01)；與模型組比較，丹參酮ⅡA組和卡托普利組的HWI和LVWI下降均顯著下降(P< 0.01)。見表1。

組別HWILVWI假手術組2．63±0．132．08±0．11模型組3．23±0．25?2．75±0．20?卡托普利組2．82±0．32#2．29±0．29#丹參酮ⅡA組2．88±0．20#2．36±0．20#

注：與假手術組比較，*P<0.01;與模型組比較，#P<0.01

2.3 心肌組織HE染色結果 光鏡下觀察可見：假手術組大鼠心肌纖維排列整齊，橫紋明顯，胞核結構清晰，無細胞腫脹，心肌間質及微血管結果正常；模型組大鼠心肌纖維明顯增粗，排列紊亂、部分心肌細胞水腫、淺染，橫紋模糊，偶見心肌斷裂，肌束間隙呈不同程度增大，胞核固縮，部分出現局灶性、片狀壞死，間質可見炎性細胞浸潤；丹參酮ⅡA組和卡托普利組均有不用程度改善。

A: 假手術組； B: 模型組； C: 卡托普利組； D: 丹參酮ⅡA組；

圖1 4組大鼠心肌HE染色

2.4 心肌羥脯氨酸含量檢測 造模8周時，與假手術組比較，模型組心肌HYP含量水平明顯增高(P<0.01)，提示壓力負荷增加大鼠心肌膠原總量升高；與模型組比較，丹參酮ⅡA組和卡托普利組HYP表達水平顯著降低(P<0.01)。見表2。

2.5 大鼠心肌NF-κB p65蛋白的表達 造模8周時，免疫組織化學法檢測大鼠心肌NF-κB p65蛋白表達水平，NF-κB p65蛋白陽性成分為棕褐色，在心肌細胞顯著高表達，在炎性細胞和內皮細胞也有表達。與假手術組比較，模型組NF-κB p65蛋白表達水平增高(P<0.01)。與模型組比較，丹參酮ⅡA組和卡托普利組下降更明顯(P<0.01)。見表2、圖2。

假手術組 模型組 卡托普利組 丹參酮Ⅱ A組

圖2 4組大鼠心肌NF-κB p65蛋白表達

組別HYP(μg/g)NF?κBp65(MD)假手術組457±1250．0812±0．0053模型組758±145?0．0354±0．0066?卡托普利組483±29#0．0443±0．0057#丹參酮ⅡA組521±141#0．0162±0．0062#

注：與假手術組比較，*P<0.01; 與模型組比較，#P<0.01

3 討論

心室重構涉及心臟細胞和間質的基因、分子和細胞的改變，包括心臟擴張、間質纖維化以及心臟收縮和舒張功能下降[6]。心臟結構的主要變化是心臟肥厚和心肌纖維化。心臟肥厚的程度與心力衰竭患者的病死率密切相關。在心室重構模型中，HMI是評估心臟肥厚程度的主要指標[6]。在本研究中，用HMI和LVMI顯著增加來評估心臟肥厚的程度，而丹參酮ⅡA能顯著減輕心臟肥厚。

在心室重構的過程中，大量的膠原分泌并聚集在心肌間質和血管周圍。膠原分泌的增加和聚合導致心肌僵硬度增加、心肌結構的改變、心室重構的發生，并最終導致心室功能障礙[7]。因此，抑制心肌纖維化能改善心臟功能。本研究顯示，丹參酮ⅡA能顯著減輕心肌HYP含量，即心肌膠原含量。因此，我們推測，丹參酮ⅡA能減少膠原分泌和合成，阻止心肌纖維化，延緩心室重構和心力衰竭進程。

心肌細胞壞死激活先天免疫促發一個強大的炎癥反應，最終導致修復性反應。盡管壓力負荷增加不能導致心肌細胞壞死，但也能誘導心肌細胞炎性反應。神經內分泌激活通過活性氧的產生和NF-κB系統的活化直接刺激炎癥反應，血管緊張素Ⅱ和醛固酮也可增強NF-κB活性，直接刺激心肌炎癥反應，此外，壓力負荷增加還可通過活化基質金屬蛋改變誘導心肌細胞外基質[8]。

在正常心臟組織中，NF-κB與它特異性抑制劑IκBα結合，可以防止NF-κB活化，壓力或容量負荷增加引發多種途徑介導細胞應激能激活IκBα激酶，進而使IκBα磷酸化，從而釋放NF-κB，使NF-κB轉變成轉錄活性[9]。盡管NF-κB本身并不是激活膠原轉錄所必須的，但它能間接增加基質金屬蛋白酶的表達，尤其是明膠酶基質金屬蛋白酶-2和基質金屬蛋白酶-9[10]；NF-κB通路還可上調結締組織生長因子的表達而促進纖維化的發生與發展[11]。在本研究中，免疫組化染色顯示，壓力負荷增加可誘導NF-κB p65陽性表達在心肌和間質均有表達，這提示壓力負荷增加不僅僅誘導心肌細胞表達NF-κB，而且心肌間質也有表達；給予TanⅡA 4周后，NF-κB p65蛋白的表達顯著下調。這些研究結果提示，抑制NF-κB p65可顯著減少心肌膠原合成，降低心肌膠原含量，減輕心肌纖維化，進而改善壓力負荷增加大鼠左心室重構。因此，我們認為丹參酮ⅡA能通過抑制NF-κB p65的表達而有效地延緩或防止心肌纖維化的發生。

綜上所述，NF-κB p65在心肌纖維化的發生和發展過程中起著重要作用。丹參酮ⅡA可降低心室質量指數和左心室重量指數，抑制心臟肥厚和心肌間質膠原合成，減輕心肌纖維化和心室重塑，改善壓力負荷大鼠心肌纖維化，其作用可能與部分抑制NF-κB p65表達有關。抑制NF-κB 信號將為心肌纖維化的防治提供新的途徑。

1 Li YC,Liu YY,Hu BH,et al.Attenuating effect of post-treatment with QiShen YiQi Pills on myocardial fibrosis in rat cardiac hypertrophy.Clin Hemorheol Microcirc,2012,51:177-191.

2 Li Q,Verma IM.NF-kappaB regulation in the immune system.Nat Rev Immunol,2002,2:725-734.

3 Zhang DM,Qin Y,Niu FL,et al.Effects of tanshinones Ⅱ_A on proliferation and typeⅠcollagen synthesis of rat cardiac fibroblasts.Liaoning Zhongyi Zazhi,2008,35:1934-1936.

4 Cai H,Zhao MZ,Xiu CY,et al.Tanshinone inhibits lysophosphatidic acid-induced cardiac fibroblast proliferation and TGF-β1 production in neonate rats.Yixue Yanjiusheng Xuebao,2008,21:126-128.

5 Anversa P,Olivetti G,Melissari M,et al.Morphometric study of myocardial hypertrophy induced by abdominal aortic stenosis.Lab Invest,1979,40:341-349.

6 Gao JP,Chen CX,Wu Q,et al.Effect of sodium houttuyfonate on inhibiting ventricular remodeling induced by abdominal aortic banding in rats.Can J Physiol Pharmacol,2010,88:693-701.

7 Brower GL,Gardner JD,Forman MF,et al.The relationship between myocardial extracellular matrix remodeling and ventricular function.Eur J Cardiothorac Surg,2006,30:604-610.

8 Xia Y,Lee K,Li N,et al.Characterization of the inflammatory and fibrotic response in a mouse model of cardiac pressure overload.Histochem Cell Biol,2009,131:471-481.

9 Hedhli N,Lizano P,Hong C,et al.Proteasome inhibition decreases cardiac remodeling after initiation of pressure overload.Am J Physiol Heart Circ Physiol,2008,295:H1385-H1393.

10 Meiners S,Hocher B,Weller A,et al.Downregulation of matrix metalloproteinases and collagens and suppression of cardiac fibrosis by inhibition of the proteasome.Hypertension,2004,44:471-477.

11 宋維芳,徐軍全,許瑞玲,等.抑制核轉錄因子-κB對纖維化肝組織中CTGF表達的影響.山西醫科大學學報,2010,41:407-410.

EffectoftanshinoneⅡAonexpressionofmyocardialNF-κBinratswithpressureoverload

CAIHui，CAIJiayu，CHANGWenjing,etal.DepartmentofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine,GeneralHospitalofNanjingMilitaryCommand,Nanjing210002,China

ObjectiveTo observe the effect of tanshinone ⅡA (Tan Ⅱ A) on expression of myocardial NF-κB in rats with pressure overload,and to explore its protective effects on myocardial fibrosis.MethodsThe pressure overload myocardial fibrosis models were established by abdominal aorta constriction in Sprague-Dawley (SD) rats,these rats were randomly divided into four groups:sham-operation group,model group,Tan Ⅱ A group (20mg·kg-1·d-1) and positive control group (captopril 100mg·kg-1·d-1),with 8 rats in each group.4 weeks after the operation,the animal models were successfully established,then the rats were given drugs,with a course of 4 weeks.After 8 weeks,left ventricular mass index,myocardial tissue pathological changes,myocardial hydroxyproline content,myocardial NF-κB p65 expression were detected in rats of the four groups.ResultsAs compared with those in sham-operation group,cardiac mass index and left ventricular mass index were significantly increased in model group (P<0.01); as compared with those in model group,these indexes were obviously decreased in Tan Ⅱ A group (P<0.01).As compared with that in sham-operation group,myocardial hydroxyproline content was significantly increased in model group (P<0.01),however,as compared with that in model group,myocardial hydroxyproline content was obviously decreased in Tan Ⅱ A group (P<0.01).As compared with those in sham-operation group,NF-κB p65 protein expression levels in myocardial tissues were significantly increased in model group (P<0.01),however,as compared with those in model group,which were significantly decreased in Tan Ⅱ A group (P<0.01).ConclusionTan Ⅱ A can inhibit cardiac hypertrophy,relieve myocardial fibrosis,and the effect may be related to down-regulation of the expression of NF-κB.

tanshinone ⅡA;pressure overload; myocardial fibrosis; NF-κB

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.02.006

項目來源：南京軍區南京總醫院科研基金面上課題(編號：2010Q027)

210002 南京市，南京軍區南京總醫院中西醫結合科

R 542.23

A

1002-7386(2014)02-0180-04

2013-09-11)