胃癌患者外周血CEAmRNA和CK20mRNA聯(lián)合檢測及意義

王玉文 任意 費建東 聶雙發(fā)

·論著·

胃癌患者外周血CEAmRNA和CK20mRNA聯(lián)合檢測及意義

王玉文 任意 費建東 聶雙發(fā)

目的 探討胃癌患者外周血中CEAmRNA和CK20mRNA表達情況及臨床意義。方法應(yīng)用RT-PCR方法檢測56例胃癌患者，20例胃良性病變患者外周血CEAmRNA和CK20mRNA。結(jié)果胃癌組，CEAmRNA及CK20m RNA的陽性率與良性組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；二者聯(lián)合檢測陽性率為76.8%，較單項陽性率高組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；腫瘤不同分化程度，組織類型，臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的CEAmRNA的陽性表達間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；不同腫瘤組織類型，臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移CK20mRNA的陽性表達間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)論聯(lián)合檢測有助于提高腫瘤微轉(zhuǎn)移檢出率，其表達與臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)。可作預(yù)后參考指標。

胃癌；CEAmRNA；CK20mRNA；微轉(zhuǎn)移

胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，胃癌患者根治術(shù)后治愈率較低，而導致患者死亡的最主要原因是腫瘤的復發(fā)和轉(zhuǎn)移。腫瘤微轉(zhuǎn)移是復發(fā)轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)和前提條件。微轉(zhuǎn)移指病理檢查、影像學技術(shù)等方法難以檢出的非血液系統(tǒng)惡性腫瘤播散并生存于血循環(huán)、淋巴道、骨髓及各器官組織中尚未形成轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的微小腫瘤細胞轉(zhuǎn)移灶[1]。微轉(zhuǎn)移是影響患者預(yù)后的重要因素，其檢測有助于提高臨床診斷，使患者及時接受手術(shù)，并可加強術(shù)后的監(jiān)測，從而提高患者術(shù)后生存率。由于微轉(zhuǎn)移的腫瘤細胞常以單個或微小細胞團存在，因此常規(guī)檢查難以發(fā)現(xiàn)，腫瘤標志物的出現(xiàn)使微轉(zhuǎn)移的檢測成為可能。近年來，PCR技術(shù)的廣泛應(yīng)用，使該研究取得了很大進展，從而提高了胃癌患者微轉(zhuǎn)移的檢出率。本研究通過檢測胃癌患者CEAmRNA與CK20mRNA在外周血中的表達，探討其作為判斷外周血微轉(zhuǎn)移及預(yù)后的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集黃驊市人民醫(yī)院2008年至2011年收治的56例胃癌患者臨床病理資料，56例均行胃鏡檢查且病理明確為胃癌，其中男32例，女24例；年齡31～75歲，平均年齡59.7歲；分化程度：高中分化23例，低分化33例；組織學類型：腺癌29例，黏液腺癌17例，印戒細胞癌10例；腫瘤部位：賁門胃底9例，胃體20例，胃竇27例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移27例，29例無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；臨床分期：Ⅰ～Ⅱ期24例，Ⅲ～Ⅳ期32例。本組患者術(shù)前未行各種治療。胃腸道良性腫瘤20例，其中包括胃潰瘍，胃平滑肌瘤，胃腺肌瘤等。

1.2 方法

1.2.1 標本采集及單個核細胞的提取：用含乙二胺四乙酸抗凝的密封試管采集清晨空腹肘前靜脈血5 ml，采用密度梯度離心法，用淋巴細胞分離液提取單個核細胞，細胞計數(shù)約106～107/ml，然后再用Trizol提取液提取總RNA。

1.2.2 RT-PCR：將各反應(yīng)管快速離心混勻，置PCR儀中，按反應(yīng)條件：42℃孵育60 min，以mRNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成第一條cDNA鏈，再99℃預(yù)變性5 min，滅活反轉(zhuǎn)錄酶，同時使雜交的RNA/cDNA變性，合成第二條cDNA鏈，然后進行PCR擴增各個標記物的cDNA引物序列，并用肌動蛋白作內(nèi)對照。PCR產(chǎn)物6 μl上樣于2%瓊脂糖凝膠(0.5 μg/ml溴化乙錠)，電泳。

1.2.3 檢測PCR產(chǎn)物：紫外成像儀成像并測出陽性者。

1.3 統(tǒng)計學分析 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 CEAmRNA與CK20 mRNA在各組中的表達 胃癌組CEAmRNA與CK20mRNA的陽性率與良性組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2 聯(lián)合檢測陽性率(至少一項陽性)與單項陽性率的比較 惡性組中，聯(lián)合檢測陽性率，與CEAmRNA及CK20mRNA單項陽性率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但是可以提高檢出率。見表2。

2.3 CEAmRNA與CK20mRNA的表達情況與腫瘤臨床病理特點的關(guān)系 患者不同性別，年齡，腫瘤位置CEAmRNA的陽性表達間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，腫瘤不同分化程度，組織類型，臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；患者不同性別，年齡，腫瘤位置，分化程度CK20mRNA的陽性表達間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.04)，腫瘤不同的組織類型，臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表1 CEAmRNA與CK20 mRNA在各組中的表達 例(%)

注：與胃癌組比較，*P<0.05

表2 聯(lián)合檢測陽性率與單項陽性率的比較 例

表3 CEAmRNA與CK20mRNA的表達與腫瘤臨床因素的關(guān)系 例(%)

3 討論

目前研究認為胃癌患者術(shù)后轉(zhuǎn)移和復發(fā)是胃癌治療失敗的主要原因。鄭樹等[2]的研究認為臨床轉(zhuǎn)移一般都是由微轉(zhuǎn)移發(fā)展而來。血行轉(zhuǎn)移是胃癌患者轉(zhuǎn)移的主要途徑之一，及早發(fā)現(xiàn)患者血液中是否有微轉(zhuǎn)移可篩選出有轉(zhuǎn)移傾向的高危患者，對指導診斷治療和判斷預(yù)后具有一定的意義。一般當發(fā)生微轉(zhuǎn)移時，患者常無臨床癥狀，常規(guī)的彩超，CT，MRI，病理檢查很難發(fā)現(xiàn)。目前認為對外周血中腫瘤標志物的檢測是確診微轉(zhuǎn)移的主要方法[3]，但是外周血中這些標志物水平較低，常規(guī)的檢測方法檢測不到，容易漏診，而RT-PCR可以通過對目的基因擴增從而檢測出含量很少的檢測物，因此RT-PCR是目前用于檢測腫瘤微轉(zhuǎn)移的常用分子生物學方法[4]。

CK20是細胞角蛋白的一種組分，具有上皮特異性分布，在正常的血液及骨髓中均不表達，它主要分布在胃腸黏膜上皮細胞、尿路黏膜表層細胞和表皮的Merkel細胞，并且特異性地存在于這些細胞來源的腫瘤內(nèi)[5]。有研究認為CK20與結(jié)腸癌、移行細胞癌的分化、分期有關(guān)[6]。CEA在胚胎中大量存在，在正常成人血中存在微量；CEAmRNA存在于細胞內(nèi)，幾乎僅在腫瘤細胞中出現(xiàn)持續(xù)表達。現(xiàn)在臨床上大都檢測血漿中的CEA蛋白，有時細胞內(nèi)CEA大量增殖，卻不分泌CEA蛋白到細胞外，因此細胞內(nèi)CEAmRNA的檢測意義更大[7]。本研究結(jié)果顯示胃癌患者中55.4%的CK20mRNA的陽性，而良性組中未檢測到CK20mRNA的表達。盛虹等[8]的研究有48.1%的胃癌患者外周血中檢測到CK20mRNA的表達，正常對照組及良性病變組中未檢測CK20mRNA的表達，表明CK20mRNA在多數(shù)胃癌患者中存在。本研究中胃癌患者外周血中CEAmRNA的陽性表達率分別是62.5%，而良性組中無表達，與楊萬勇等[9]的研究結(jié)果相符。可見胃癌患者外周血CEAmRNA與CK20mRNA的陽性表達可以認為外周血中有腫瘤細存在，可以作為癌細胞血液轉(zhuǎn)移的重要標志之一。聯(lián)合檢測陽性率(兩項至少有一項陽性)為76.8%，較單項陽性率(CEAmRNA為62.5%，CK20mRNA為55.4%)為高，雖然差異無統(tǒng)計學意義，但提示聯(lián)合檢測有助于提高檢出率。同時，本資料還證實CEAmRNA的陽性表達與腫瘤患者的性別、年齡和腫瘤位置無明顯關(guān)系，而與分化程度，組織類型，臨床分期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)，差異有統(tǒng)計學意義；CK20mRNA的陽性表達與腫瘤患者的性別、年齡和腫瘤位置，分化程度無明顯關(guān)系，而與組織類型，臨床分期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)，差異有統(tǒng)計學意義，與大多數(shù)研究結(jié)果[10，11]一致。以上結(jié)果可能由于腫瘤分期越晚，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移越多，陽性率就越高，即隨著腫瘤的逐漸增大，釋放入血循環(huán)中的癌細胞也越多，復發(fā)或轉(zhuǎn)移的幾率就越大，預(yù)后就愈差。并且發(fā)現(xiàn)隨著臨床分期的增加，這些腫瘤標志物的表達率也明顯升高，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者較未轉(zhuǎn)移的患者陽性率也明顯升高。有研究表明CEAmRNA與CK20mRNA的表達與腫瘤的病期和預(yù)后密切相關(guān)[11]。

總之，通過RT-PCR檢測胃癌患者血液中CEAmRNA與CK20mRNA的表達，可以監(jiān)測腫瘤細胞的血行轉(zhuǎn)移，是一種較好的診斷胃癌轉(zhuǎn)移復發(fā)的方法。微轉(zhuǎn)移的檢測較常規(guī)檢查具有更高的敏感性，是一個重要的指標，對胃癌患者分期、判斷預(yù)后、確定手術(shù)方式和術(shù)后的綜合治療方案具有重要的指導作用。

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9 楊萬勇，杜宗孝，蔡永梅，等.胃癌患者外周血癌細胞CEAmRNA表達與胃癌微轉(zhuǎn)移關(guān)系的研究.寧夏醫(yī)學雜志，2001，23：262-264.

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10.3969/j.issn.1002-7386.2014.02.015

061100 河北省黃驊市人民醫(yī)院外一科(王玉文、任意)；河北北方學院附屬第一醫(yī)院普外科(費建東、聶雙發(fā))

R 735.2

A

1002-7386(2014)02-0200-03

2013-07-15)