肺癌組織Lipocalin-2表達與肺癌預后的關系

馬小剛 楊曉光 趙崢

·論著·

肺癌組織Lipocalin-2表達與肺癌預后的關系

馬小剛 楊曉光 趙崢

目的探討肺癌組織脂質運載蛋白-2(Lipocalin-2)表達與基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)、腫瘤侵襲轉移及預后的關系。方法采用免疫組織化學SP法檢測Lipocalin-2、MMP-9在55例肺癌組織及40例正常肺組織的表達，分析其表達與臨床病理特征、復發率間的關系。采用Western blot檢測Lipocalin-2在肺鱗癌和腺癌組織的表達差異。結果Lipocalin-2、MMP-9在肺癌組織的陽性表達率顯著高于正常肺組織，差異有統計學意義(P<0.05)，且Lipocalin-2表達與MMP-9呈顯著正相關(r=0.586，P<0.05)。Lipocalin-2陽性表達率隨著腫瘤TNM臨床分期的增高及淋巴結遠處轉移而增高。Lipocalin-2高表達者術后3年肺癌復發率顯著高于低表達者，差異有統計學意義(P<0.05)。Lipocalin-2在肺腺癌組織的表達高于鱗癌組織，差異有統計學意義(P<0.05)。結論肺癌組織Lipocalin-2的異常高表達參與了腫瘤的侵襲轉移過程，可作為預后判斷的指標。

肺腫瘤；脂質運載蛋白-2；預后

肺癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，患者預后差，致死率高。脂質運載蛋白-2(Lipocalin-2)是載脂蛋白家族成員之一，其表達水平與細胞凋亡、胰島素抵抗、代謝綜合征及血管病變等多個生理和病理過程有關。研究發現，Lipocalin-2在乳腺癌等上皮細胞腫瘤中表達上調，與腫瘤進展密切相關[1]。本研究采用免疫組織化學SP法檢測Lipocalin-2在肺癌組織的表達,旨在探討Lipocalin-2表達與基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)、癌細胞侵襲轉移及預后的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2011年1月至2012年12月我院手術切除的肺癌組織標本55例，均經病理確診，男39例，女16例；年齡34～76歲，中位年齡53.6歲；患者術前均未接受放療、化療和內分泌治療，臨床病理資料完整。病理類型：鱗癌24例，腺癌18例，小細胞癌13例。TNM臨床分期參照2002年UICC制定的標準：Ⅰ+Ⅱ期22例，Ⅲ+Ⅳ期33例。55例肺癌患者中有淋巴結轉移者35例，無淋巴結轉移者20例。另取40例正常肺組織作為對照。2組患者年齡、性別比、體重等一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05)。

1.2 試劑 兔抗鼠Lipocalin-2多克隆抗體、兔抗人MMP-9多克隆抗體購自Santa Cruz公司。免疫組化SP試劑盒購自上海生工生物工程技術服務有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 免疫組化：采用免疫組織化學染色SP法測定Lipocalin-2、MMP-9的表達，嚴格按照試劑盒說明書操作，用已知陽性切片作為陽性對照，用PBS代替一抗作為陰性對照。判定標準：Lipocalin-2、MMP-9陽性染色的判定標準為在細胞質或細胞膜中檢出黃色或棕黃色顆粒。隨機選取5個有代表性的視野(×400)計數200個細胞，若陽性細胞占同類細胞的百分比≥10%為陽性，<10%為陰性。

1.3.2 Western blot：取凍存肺癌組織及正常肺組織石蠟標本，Western blot 檢測Lipocalin-2蛋白表達。提取組織總蛋白，BCA法定量蛋白后進行SDS-聚丙酰胺凝膠電泳，電轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，特異性一抗4℃孵育過夜，IgG二抗孵育2 h，ECL顯色。采用UVP分析軟件對目的條帶及內參照條帶做灰度值分析。

2 結果

2.1 Lipocalin-2、MMP-9蛋白在肺癌及正常肺組織的表達 Lipocalin-2、MMP-9蛋白主要定位于細胞膜和細胞質中，呈線狀棕黃色顆粒。在正常肺組織Lipocalin-2僅少量表達(7.5%)，MMP-9不表達，二者在肺癌組織均高表達(分別為78.2%和81.8%)，與正常肺組織比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 2組Lipocalin-2、MMP-9蛋白表達水平比較 例(%)

注：與對照組比較，*P<0.05

2.2 Lipocalin-2表達與MMP-9的關系 43例Lipocalin-2表達陽性的肺癌組織中MMP-9陽性表達率為79.1%(34/43)，12例Lipocalin-2表達陰性的肺癌組織中MMP-9陽性表達率為16.7%(2/12)，2組比較差異有統計學意義(χ2=26.134，P<0.05)。Spearman等級相關性分析顯示，Lipocalin-2、MMP-9表達呈明顯正相關(r=0.586，P<0.05)。見表2。

表2 Lipocalin-2、MMP-9在肺癌組織表達的相關性比較 例

2.3 Lipocalin-2表達與肺癌臨床病理特征的關系 Lipocalin-2陽性表達率隨著腫瘤TNM臨床分期的增高及淋巴結遠處轉移而增高(P<0.05)。見表3。

2.4 Lipocalin-2在不同病理類型肺癌組織的表達 Western blot結果顯示，Lipocalin-2在肺腺癌組織的表達較鱗癌及正常肺組織顯著增高，差異有統計學意義(P<0.05)，而肺鱗癌組織和正常肺組織比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 Lipocalin-2在不同病理類型肺癌組織的表達

類別β-actinLipocalin-2Lipocalin-2/β-actin相對灰度值肺腺癌組織(n=18)68.21±2.3759.32±1.030.87±0.06*肺鱗癌組織(n=24)70.22±2.4641.56±0.770.59±0.11正常肺組織(n=40)74.25±2.7739.89±1.010.54±0.08

注：與正常肺組織比較，*P<0.05

2.5 Lipocalin-2表達與復發轉移的關系 術后對肺癌患者跟蹤隨訪3年，結果顯示，55例肺癌患者3年總復發率為41.8%(23/55)，Lipocalin-2陽性表達復發率為58.1%(25/43)，Lipocalin-2陰性表達復發率為25.0%(3/12)，差異有統計學意義(P<0.05)。

3 討論

Lipocalin-2，即中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白，是屬于Lipocalin超家族的一種脂肪細胞因子，其最早被Kjeldsen等[2]在中性粒細胞上清液中發現并分離。研究顯示，Lipocalin-2具有廣泛的生物學功能，在炎癥、代謝綜合征、糖尿病及胰島素抵抗、動脈粥樣硬化等病理過程中扮演重要角色，可作為這些疾病發生的風險預測及預后評估的重要指標。研究發現，Lipocalin-2的異常表達參與了包括乳腺癌、結腸直腸癌、胰腺癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤細胞的增殖和侵襲轉移過程[3,4]，且隨著不同的組織類型其表達水平呈現上調或下調。

惡性腫瘤侵襲和轉移的關鍵步驟是通過降解細胞外基質成分和基底膜突破基質屏障，其中基質金屬蛋白酶(MMPs)是發揮降解作用的最重要蛋白水解酶，而MMP-9被認為是MMPs中與Lipocalin-2功能聯系最緊密的成員，與腫瘤擴散、侵潤和轉移密切相關[2]。本研究發現，Lipocalin-2與MMP-9在肺癌組織均異常高表達，且二者表達呈顯著正相關(r=0.586，P<0.05)，這與文獻報道的在乳腺癌和口腔癌中的研究結果[5,6]一致，提示Lipocalin-2作為一種轉移促進基因直接促進了癌細胞的侵潤和轉移。既往研究顯示，Lipocalin-2與MMP-9之間可能存在某種調控作用，共同參與了肺癌的發生發展，其機制可能為Lipocalin-2通過促進MMP-9活化、抑制MMP-9降解，促進了腫瘤的浸潤和轉移過程[7]。Western blot結果顯示，Lipocalin-2在肺腺癌組織的表達多于鱗癌組織，與Cho 等[8]研究結果一致，進一步證實了Lipocalin-2高表達與肺腺癌密切有關。本研究結果也顯示，Lipocalin-2陽性表達率隨著肺癌臨床分期的增高和淋巴結遠處轉移而增高，另外，Lipocalin-2陽性表達率高的患者術后3年內復發率顯著高于Lipocalin-2陰性表達者，提示Lipocalin-2陽性患者具有更強的侵襲轉移潛能，腫瘤惡性程度更高，預后更差。

綜上所述，Lipocalin-2在肺腺癌組織過度表達，其表達水平與腫瘤TNM臨床分期、淋巴結轉移及預后密切相關，減低或敲除Lipocalin-2表達有可能成為肺癌生物學治療的新策略。由此可見，Lipocalin-2在促進肺癌發展進程中起非常重要的作用，其表達水平可為評價肺癌發展、侵襲轉移及預后提供重要參考價值，有可能成為肺癌臨床治療的新靶標及判斷轉移和預后的重要預測因子。

1 Yang J,McNeish B,Butterfield C,et al.Lipocalin 2 is a novel regulator of angiogenesis in human breast cancer.FASEB J,2013,27:45-50.

2 Kjeldsen L,Johnsen AH,Sengelov H,et al.Isolation and primary structure of NGAL,a novel protein associated with human neutrophil gelatinase.J Biol Chem,1993,268:10425-10432.

3 Leng X,Ding T,Lin H,et al.Inhibition of lipocalin 2 impairs breast tumorigenesis and metastasis.Cancer Res,2009,69:8579-8584.

4 Tung MC,Hsieh SC,Yang SF,et al.Knockdown of lipocalin-2 suppresses the growth and invasion of prostate cancer cells.Prostate,2013,73:1281-1290.

5 Sung H,Choi JY,Lee SA,et al.The association between the preoperative serum levels of lipocalin-2 and matrix metalloproteinase-9(MMP-9) and prognosis of breast cancer.BMC Cancer,2012,12: 193.

6 Lin CW,Tseng SW,Yang SF,et al.Role of lipocalin 2 and its complex with matrix metalloproteinase-9 in oral cancer.Oral Dis,2012,18:734-740.

7 須靜，胡曉波.中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白的研究進展．檢驗醫學，2012，27:871-876.

8 Cho H,Kim JH.Lipocalin 2 expressions correlate siginificantly with tumor differentiation in epithelial ovarian cancer.J Histochem Cytochem,2009,57:513-521.

RelationshipbetweentheexpressionofLipocalin-2andtheprognosisofpatientswithprimarylungcancer

MAXiaogang,YANGXiaoguang,ZHAOZheng.DepartmentofThoracicSurgery,HandanCentralHospital,Hebei,Handan056001,China

ObjectiveTo investigate the expression of Lipocalin-2 and its relationship with MMP-9 as well as prognosis of patients with primary lung cancer.MethodsThe expression levels of Lipocalin-2 and MMP-9 were detected by immunohistochemistry(SP) in 55 cases of lung cancer tissues and 40 cases of normal lung tissues.The relationship between Lipocalin-2 expression and clinicopathological features of lung cancer as well as relapse rate was analyzed.Western blot was used to detect the expression of Lipocalin-2 in lung adenocarcinoma and lung squamous carcinoma.ResultsThe positive expression rates of Lipocalin-2 and MMP-9 in lung cancer tissues were significantly higher than those of normal lung tissues(P<0.05),furthermore,the expression of Lipocalin-2 was positively correlated to that of MMP-9(r=0.586,P<0.05).The positive expression rate of Lipocalin-2 was increased,with the increase of clinical stage and lymph node metastasis of lung cancer.The 3-year relapse rate after operation in patients with higher expression of Lipocalin-2 was significantly higher than that in patients with lower expression of Lipocalin-2(P<0.05).The expression levels of Lipocalin-2 in lung adenocarcinoma were significantly higher than those in lung squamous carcinoma(P<0.05).ConclusionThe overexpression of Lipocalin-2 plays an important role in the invasion and metastasis of primary lung cancer,which can be used as a index for evaluating prognosis of patients with lung cancer．

lung cancer; lipocalin-2; prognosis

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.11.008

056001 河北省邯鄲市中心醫院胸外科

R 734.2

A

1002-7386(2014)11-1626-03

2013-12-15)