平陽霉素新輔助化療對陰莖癌組織c—myc、Ras—P21、P53蛋白表達影響的研究

徐磊 劉文龍 王志超 喬忠杰

[摘要] 目的 探討應(yīng)用平陽霉素新輔助化療對陰莖癌組織基因蛋白c-myc、Ras-P21、P53表達的影響及意義。 方法 收集哈爾濱醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院泌尿外科1995～2005年罹患陰莖鱗狀細胞癌的住院患者100例，按照術(shù)前是否進行輔助化療分為兩組，其中新輔助化療組50例，術(shù)前應(yīng)用平陽霉素化療7 d，化療后行陰莖部分切除術(shù)，并行雙側(cè)腹股溝淋巴結(jié)改良清掃術(shù)；對照組50例，直接行手術(shù)治療（手術(shù)治療方法同新輔助化療組），術(shù)前不進行化學藥物治療。應(yīng)用免疫組織化學法（SP）對兩組患者的陰莖鱗狀細胞癌組織進行c-myc、Ras-P21以及P53等指標檢測。 結(jié)果 新輔助化療組組織標本中c-myc、Ras-P21、P53等指標表達的陽性率經(jīng)檢測分別為30%、27%、23%。對照組組織標本中，c-myc、Ras-P21、P53等指標表達的陽性率經(jīng)檢測分別為52%、48%、50%。新輔助化療組與對照組的c-myc、Ras-P21、P53指標表達陽性率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。 結(jié)論 應(yīng)用平陽霉素新輔助化療后，陰莖鱗狀細胞癌組織中c-myc、Ras-P21、P53蛋白的表達明顯下降，平陽霉素新輔助化療可降低陰莖癌的惡性程度。

[關(guān)鍵詞] 陰莖癌；平陽霉素；新輔助化療；免疫組織化學法

[中圖分類號] R737.27 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2014）07（c）-0004-04

陰莖鱗狀細胞癌是陰莖最常見的惡性腫瘤，傳統(tǒng)的治療方法多采用陰莖部分或全部切除配合腹股溝淋巴結(jié)清掃術(shù)[1]。臨床采用平陽霉素新輔助化療配合改良的淋巴結(jié)清掃術(shù)治療陰莖癌取得了良好的效果。平陽霉素是由我國自主研制的抗腫瘤藥物，從放線菌（Streptomycespingyangensisn.sp）培養(yǎng)液中分離得到，目前已成為我國臨床常用的抗癌藥物，被廣泛應(yīng)用于治療頭頸部等部位鱗癌、皮膚癌、食道癌、外陰癌、惡性淋巴瘤、乳腺癌和宮頸癌等惡性腫瘤。近年來，平陽霉素在臨床應(yīng)用過程中有不少新的發(fā)現(xiàn)與擴展。本研究應(yīng)用免疫組織化學法研究平陽霉素新輔助化療后陰莖癌患者腫瘤組織中c-myc、Ras-P21、P53蛋白表達的變化，以證實平陽霉素新輔助化療治療陰莖癌的效果。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇哈爾濱醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院（以下簡稱“我院”）1995～2005年罹患陰莖鱗狀細胞癌患者100例，所有病例均附有完整的臨床資料。年齡35～86歲，平均（42.2±0.03）歲；病程5個月～3年，平均（1.6±0.02）年。其中包莖83例，包皮過長17例；臨床表現(xiàn)為陰莖頭部、冠狀溝、包皮內(nèi)板處丘疹、潰瘍、菜花狀腫物，膿性分泌物80例，惡臭76例，3例尿道狹窄，有排尿困難；術(shù)前、術(shù)后病理檢測均為陰莖鱗狀細胞癌，83%以上的患者有腹股溝淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。按照術(shù)前是否進行輔助化療分為新輔助化療組和對照組，每組各50例。兩組患者一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 治療方法 新輔助化療組50例，術(shù)前于陰莖頭腫瘤處取病理組織證實為鱗狀細胞癌。常規(guī)血液檢驗如血常規(guī)、肝腎功能等，并行胸部正側(cè)位X線片檢查，結(jié)果正常后進行化療。化療方案如下：平陽霉素8 mg+生理鹽水2 mL深部肌內(nèi)注射，每天1次。同時可給予對癥支持治療，給藥時間為7 d，2周后經(jīng)各項檢查正常后行陰莖部分切除術(shù)加改良腹股溝淋巴結(jié)清掃術(shù)。

對照組50例，術(shù)前于陰莖頭腫瘤處取病理組織證實為鱗狀細胞癌。術(shù)前未行任何治療，行陰莖部分切除術(shù)+改良的腹股溝淋巴結(jié)清掃術(shù)。

1.2.2 病理檢查方法 本研究的所有標本均來自我院病理科，附有查找完整的臨床資料。兩組患者術(shù)后病理均取材于陰莖頭腫瘤組織，檢測均為陰莖鱗狀細胞癌，標本經(jīng)10%福爾馬林固定、石蠟包埋。每個標本均制成5 μm厚的組織切片3張，3張切片均行c-myc、Ras-P21、P53免疫組化染色。

采用免疫組織化學SP法：石蠟切片脫蠟和水化后，沖洗3次；將過氧化酶阻斷劑加入；PBS（pH=7.4）沖洗3次；抗原微波修復，pH6.0枸櫞酸緩沖液共計15 min沖洗，沖洗后自然冷卻，時間共20 min，再次使用PBS清洗標本3次，各1 min；將10%即用型非免疫血清加入每張切片，于37℃下孵育10 min；加入第一抗體（鼠抗人c-myc、ras-P21及P53）4℃過夜；標本加1滴或50 μL的二抗，加入二抗后于37℃下濕盒孵育30 min；使用PBS清洗標本3次，每次1 min；標本加鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化酶，37℃下孵育30 min；使用PBS清洗標本沖洗3次，每次5 min；蒸餾水沖洗2次，1 min，蘇木素復染30 s～1 min，脫水后樹膠封片。以上試劑均來自北京生物技術(shù)有限公司。

對照染色使用TBS緩沖液代替單抗，細胞膜和細胞質(zhì)可見棕黃色顆粒樣著色為Ras-P21蛋白陽性標記；細胞質(zhì)和細胞核可見棕黃色顆粒樣著色為c-myc蛋白陽性標志。P53蛋白細胞核內(nèi)有棕黃色顆粒著色為陽性標志。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 15.0對數(shù)據(jù)進行分析，正態(tài)分布計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗。計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

兩組患者術(shù)后免疫組織化學SP法結(jié)果顯示：對照組50例標本中表達陽性者，c-myc為26例，占52%；Ras-P21為4例，占48%；P53為23例，占46%。新輔助化療組的50例標本中表達陽性者，c-myc為15例，占30%；Ras-P21為13例，占26%；P53為11例，占22%。新輔助化療組與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見圖1～6，表1～3。

3 討論

陰莖鱗狀細胞癌是陰莖最常見的惡性腫瘤，針對陰莖鱗狀細胞癌的傳統(tǒng)治療方法多以手術(shù)為主，術(shù)式多采用陰莖全切除術(shù)、陰莖部分切除術(shù)等，因陰莖鱗狀細胞癌患者多伴有腹股溝淋巴結(jié)腫大，其中約50%經(jīng)病理證實為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，陰莖癌手術(shù)同時行雙側(cè)腹股溝淋巴結(jié)清掃術(shù)，患者創(chuàng)傷大，常因陰莖切除范圍較大而出現(xiàn)影響術(shù)后性生活甚至喪失，排尿姿勢改變等并發(fā)癥，因腹股溝淋巴結(jié)清掃術(shù)后出現(xiàn)嚴重的雙下肢及陰囊水腫等并發(fā)癥，明顯降低了患者的生活質(zhì)量。我院采用平陽霉素新輔助化療配合改良的手術(shù)治療陰莖癌，明顯地提高了陰莖癌患者生存率，降低了復發(fā)率，增加了最大保留陰莖功能的機會，提高了患者的生活質(zhì)量[2]。

近年來，Ras-P21基因在惡性腫瘤的發(fā)病中受到了一定的重視視，并被視為一種預后基因，如肺癌、腸癌[3]、膀胱癌[4]等，不但ras基因異常活化，而且P21有不同程度的表達[5]；惡性程度越高，Ras-P21表達越高，預后越差[6-10]。有學者證實Ras-P21蛋白對陰莖癌的預后、惡性度的評估有重要的參考意義[11]。

C-myc基因是myc基因家族的重要成員之一，是一種可易位基因、可調(diào)節(jié)基因，其表達的變化與細胞的增殖及分化狀態(tài)有關(guān)，其表達產(chǎn)物也參與了多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展。有學者指出，浸潤程度增高的胃癌患者的腫瘤組織標本中，c-myc基因產(chǎn)物P62的表達增強[12]，而且c-myc表達產(chǎn)物P62陽性者較陰性者預后差，復發(fā)率高[13]。有學者發(fā)現(xiàn)c-myc表達增強的陰莖癌患者，臨床期別更晚、惡性程度更高、預后更差，陰莖癌的復發(fā)、轉(zhuǎn)移率以及腫瘤相關(guān)病死率都高于c-myc表達陰性者，提示c-myc蛋白表達可以協(xié)助評價陰莖癌病情進展及預后情況[14]。

P53是一種腫瘤抑制基因，對細胞生長、凋亡和DNA修復有重要的調(diào)控作用，在近50%的惡性腫瘤中會出現(xiàn)P53基因的突變。野生型P53基因和突變型P53基因均參與細胞凋亡的調(diào)節(jié)，野生型P53對細胞凋亡有促進作用，而突變型P53則對細胞凋亡有抑制作用。而P53基因的過度表達往往源于P53基因的突變。P53突變是陰莖癌發(fā)生的早期事件[15]。研究表明P53蛋白參與了陰莖癌的發(fā)病過程[16]。

以上的研究結(jié)果表明，Ras-P21、P53以及c-myc蛋白的表達可以作為判斷陰莖癌惡性程度的良好指標。c-myc、Ras-P21、P53的陽性表達與腫瘤的組織分級、臨床分期、預后有關(guān)，分化程度越差，臨床分期越晚，陽性表達率越高，患者預后越差。

在本研究中，應(yīng)用此3個蛋白的表達程度作為判斷平陽霉素新輔助化療效果的指標，采用免疫組織化學法對應(yīng)用平陽霉素新輔助化療（新輔助化療組）和未應(yīng)用平陽霉素化療（對照組）的陰莖癌患者石蠟包埋病理組織各50例標本進行了檢測。在對照組50例患者中，Ras-P21蛋白陽性24例（48%），而新輔助化療組P21蛋白陽性13例（26%）；對照組c-myc蛋白陽性26例（52%），而平陽霉素新輔助化療組c-myc蛋白陽性15例（30%）；對照組P53蛋白陽性23例（46%），新輔助化療組P53蛋白陽性11例（22%），兩組差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），見表1～3。新輔助化療后c-myc、P21、P53蛋白表達水平均顯著降低，提示平陽霉素新輔助化療可明顯降低陰莖癌的惡性程度。

綜上所述，應(yīng)用平陽霉素新輔助化療明顯降低了Ras-P21、P53及c-myc蛋白表達的陽性率，降低了陰莖癌的惡性程度。本研究為平陽霉素新輔助化療配合手術(shù)治療陰莖癌，最大程度地保留陰莖功能，降低陰莖癌的復發(fā)率，提高患者的生存質(zhì)量及生存率提供分子生物學理論依據(jù)。平陽霉素新輔助化療治療陰莖癌值得臨床上推廣應(yīng)用。

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（收稿日期：2014-04-14 本文編輯：蘇 暢）