流式細(xì)胞術(shù)在細(xì)菌快速檢測(cè)中的應(yīng)用研究

董成霞

山東省濟(jì)南市濟(jì)陽(yáng)縣人民醫(yī)院，山東濟(jì)南 251400

流式細(xì)胞術(shù)于90年代末期被創(chuàng)建，最初僅用于臨床檢驗(yàn)和科學(xué)研究，由于微生物的粒子或細(xì)胞較小，因此在微生物領(lǐng)域應(yīng)用的較晚。但在近幾年來，隨著熒光染料的改良和豐富、光學(xué)科技的不斷完善，以及流式細(xì)胞檢測(cè)儀自身的不斷發(fā)展進(jìn)步。在如今，流式細(xì)胞術(shù)在微生物領(lǐng)域得到較為廣泛的應(yīng)用，尤其是對(duì)于細(xì)菌學(xué)問題的解決具有多參數(shù)測(cè)量精確，并且迅速的特點(diǎn)。

1 流式細(xì)胞術(shù)在環(huán)境樣品細(xì)菌檢測(cè)中的應(yīng)用

以往對(duì)環(huán)境樣品通常應(yīng)用的方法為平板法，對(duì)微生物的多樣性和總菌數(shù)的深入研究具有嚴(yán)重的制約性，常會(huì)給檢測(cè)結(jié)果帶來較大的誤差，并且其他傳統(tǒng)的檢測(cè)方法，具有操作復(fù)雜繁瑣的特點(diǎn)。但流式細(xì)胞是在環(huán)境樣品中的推廣應(yīng)用，具有測(cè)定精準(zhǔn)、制備簡(jiǎn)單、可快速的對(duì)多參數(shù)數(shù)據(jù)進(jìn)行采集，以及可對(duì)多元數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。如今，流式細(xì)胞術(shù)已廣泛的應(yīng)用于土壤、水和空氣等環(huán)境中的微生物研究的重要工具，圖1為流式細(xì)胞術(shù)的樣品制備技術(shù)。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)的樣品制備技術(shù)

曾有學(xué)者應(yīng)用熒光原位雜交技術(shù)結(jié)合流式細(xì)胞檢測(cè)儀對(duì)豬谷倉(cāng)空氣和實(shí)驗(yàn)室空氣中的微生物進(jìn)行測(cè)定。先用液化收集器獲取樣品，然后用熒光染料染色后，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)辨別樣品粉塵雜質(zhì)中的菌體，并且可通過計(jì)數(shù)處理，獲取細(xì)菌總數(shù)。流式細(xì)胞術(shù)還可用以土壤樣品的檢測(cè)，Jean Christophe等學(xué)者應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)土壤樣品中的微生物進(jìn)行定量和定性檢測(cè)。應(yīng)用溴化乙錠和跟16SrRNA具有互補(bǔ)作用的熒光探針結(jié)合光散射參數(shù)對(duì)菌體的大小進(jìn)行限定，然后從土壤微生物的粉塵碎片和群落中區(qū)分出絮凝劑產(chǎn)生菌檢測(cè)菌[1]。

另外，還有學(xué)者應(yīng)用該術(shù)對(duì)水環(huán)境進(jìn)行細(xì)胞的快速檢測(cè),采用流式細(xì)胞術(shù)和FISH對(duì)新加坡壓艙水的腸道菌數(shù)、弧菌數(shù)、細(xì)菌總數(shù)和大腸桿菌屬進(jìn)行檢測(cè)。經(jīng)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用不同取樣點(diǎn)的壓艙水，其檢測(cè)結(jié)果會(huì)存在較大的差異，該種現(xiàn)象說明航運(yùn)業(yè)的壓艙水的水質(zhì)情況較為復(fù)雜，并且受到多種因素的制約和影響。這些檢測(cè)實(shí)驗(yàn)表明，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)能夠進(jìn)行水質(zhì)檢測(cè)和污染監(jiān)測(cè)，在工業(yè)不斷發(fā)展的今天，對(duì)于生態(tài)文明建設(shè)，該監(jiān)測(cè)方法的應(yīng)用具有極為重大的意義。

2 流式細(xì)胞術(shù)在臨床細(xì)菌檢測(cè)中的應(yīng)用

流式細(xì)胞術(shù)在最初主要應(yīng)用為哺乳類動(dòng)物的檢測(cè)，在臨床上的應(yīng)用極為少見。但目前在臨床中，已得到廣泛的應(yīng)用，并且樣品的檢測(cè)范圍也從最初的的真核細(xì)胞檢測(cè)擴(kuò)展到原核生物的細(xì)胞檢測(cè)中，甚至可對(duì)更小的病毒進(jìn)行檢測(cè)。具有快速、靈敏的特點(diǎn)，對(duì)促進(jìn)病癥的及時(shí)確診具有重要的作用。較為常用，并且效果最佳的是對(duì)于菌血癥的診斷。在臨床檢查中，異質(zhì)性和藥敏性極為常見，并且兩者間具有緊密的聯(lián)系，流式細(xì)胞術(shù)在臨床細(xì)菌檢測(cè)中的應(yīng)用，最初始于對(duì)藥敏性的檢測(cè)。

Su11er曾應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)氨芐青霉素、萬(wàn)古霉素和頭孢他啶，分別對(duì)其金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌的藥敏性反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)。其結(jié)果表明，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)能夠靈敏、快速的對(duì)抗生素的抗菌效應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)應(yīng)用細(xì)胞氧化活性燃料CTC，可檢測(cè)出多個(gè)不同的細(xì)胞亞群，由于不同的細(xì)菌亞群對(duì)于抗生素敏感性并不相同，因此能夠較為直觀的反映細(xì)胞的異質(zhì)性[2]。付亮等學(xué)者應(yīng)用臨床分離出的肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌，結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)和確證實(shí)驗(yàn)兩種方法進(jìn)行兩種藥物敏感性的檢測(cè)。其檢測(cè)結(jié)果表明，流式細(xì)胞術(shù)和傳統(tǒng)的檢測(cè)結(jié)果具有一致性的特征，但更富有客觀、自動(dòng)化和快速的特性，能夠聯(lián)合應(yīng)用于藥敏性的實(shí)驗(yàn)研究。流式細(xì)胞技術(shù)還可獲取異質(zhì)性和藥敏性的相關(guān)信息，屬于有效的檢測(cè)手段。該技術(shù)在臨床疾病診斷中的優(yōu)勢(shì)，在于其檢測(cè)結(jié)果能夠幫助對(duì)疾病進(jìn)行及時(shí)的診斷，特別是對(duì)于急性病的診斷，具有較大的應(yīng)用價(jià)值。

流式細(xì)胞術(shù)在臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用，還可應(yīng)用于其他病菌的檢測(cè)。有學(xué)者曾應(yīng)用結(jié)合分支桿菌采用熒光素SYBRGreen I和二氧化硅納米顆粒兩種燃料標(biāo)記后，結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。其檢測(cè)的菌濃度可低至3.5×103～3.0×104個(gè)/mL，相對(duì)于單純使用FITC染色的流式細(xì)胞術(shù)應(yīng)用更為明顯[3]。此外，據(jù)有關(guān)實(shí)驗(yàn)表明，流式細(xì)胞術(shù)的臨床細(xì)菌診斷，并不僅僅是局限于普通的細(xì)菌檢測(cè)，還可用于休眠體的檢測(cè)，能夠在其活化前，對(duì)疾病作出診斷，進(jìn)行盡早的診斷，對(duì)于患者的康復(fù)具有重要作用。

3 流式細(xì)胞術(shù)在趨磁細(xì)菌研究中的應(yīng)用前景

趨磁細(xì)菌于1975年由美國(guó)科學(xué)家B1akemore首次發(fā)現(xiàn)，因?yàn)槠潴w內(nèi)據(jù)有較小的次磁小體，受到諸多科學(xué)家的關(guān)注。在目前，對(duì)于趨磁細(xì)菌磁小體的合成機(jī)理并沒有明確的文獻(xiàn)指出，在研究中，依然存在較多的問題。其中的關(guān)鍵性問題在于對(duì)磁小體合成量的檢測(cè)，也即磁性的表征，對(duì)于優(yōu)化磁小體的合成培養(yǎng)條件形成了限制，制約磁小體的大量合成[4]。在近幾年來，有學(xué)者曾應(yīng)用流式細(xì)胞儀對(duì)趨磁細(xì)菌進(jìn)行檢測(cè)應(yīng)用，但文獻(xiàn)較少，并且缺乏深層次的研究。

結(jié)合流式細(xì)胞儀的應(yīng)用原理，以及檢測(cè)微粒時(shí)可應(yīng)用熒光染料標(biāo)記定量測(cè)量的特點(diǎn)，初步推斷流式細(xì)胞術(shù)能夠應(yīng)用于檢測(cè)趨磁細(xì)菌磁小體合成量。因?yàn)橼叴偶?xì)菌結(jié)合體的體內(nèi)合成磁體較小，并且數(shù)量不相等，致使胞內(nèi)粒度的大小直接受到磁小體多寡的影響。根據(jù)流式細(xì)胞術(shù)側(cè)向散射光信息能夠表示細(xì)胞胞內(nèi)粒度的具體情況,因此，流式細(xì)胞術(shù)在未來的發(fā)展研究中，應(yīng)能夠用于趨磁細(xì)菌磁小體量的檢測(cè)，但在目前仍未找合適的磁小體熒光探針，所以還有待于進(jìn)一步的深入研究。此外，流式細(xì)胞術(shù)還可以應(yīng)用于趨磁細(xì)菌非趨磁標(biāo)準(zhǔn)珠和突變株的檢測(cè)研究，據(jù)有關(guān)研究觀察發(fā)現(xiàn)趨磁細(xì)菌的非區(qū)磁性的突變體能夠自發(fā)的形成[5]。但在目前的研究中，流式細(xì)胞儀應(yīng)用于趨磁細(xì)菌還存在一定的局限性，需要對(duì)其儀器精度的提升深入研究，方能進(jìn)一步的促進(jìn)流式細(xì)胞術(shù)在趨磁細(xì)菌中的應(yīng)用。

4 結(jié)語(yǔ)

流式細(xì)胞術(shù)在微生物領(lǐng)域中的應(yīng)用較廣，只要可進(jìn)行熒光分子標(biāo)記的微粒和細(xì)胞，均可應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。尤其是用以形體較為微小的粒子，具有靈敏度高、迅捷、逐個(gè)檢測(cè)、多參數(shù)分析等優(yōu)點(diǎn)。但由于其前期的應(yīng)用成本較高，并且在樣品處理和熒光染料的選擇方面仍然存在一定的局限性，還需進(jìn)一步的研究。但在現(xiàn)代科技不斷進(jìn)步發(fā)展下，流式細(xì)胞術(shù)會(huì)有更為廣闊的應(yīng)用前景。

[1]付亮,龍軍,袁小澎.流式細(xì)胞術(shù)快速檢測(cè)產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶細(xì)菌的研究[J].廣東醫(yī)學(xué),2011,2(4):181-182.

[2]徐黎明,任桂萍,尹杰超,等.基于流式細(xì)胞術(shù)的scFv抗體庫(kù)篩選技術(shù)的建立[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2013,3(1):65-68.

[3]何子純,李升錦.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)胞內(nèi)重組恥垢分枝桿菌的活力研究[J].中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志,2011,3(8):261-262.

[4]許文芳.CD64、CRP在重癥細(xì)菌感染中的診斷價(jià)值[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2011,1(2):205-206.

[5]張艷.流式細(xì)胞術(shù)在微生物檢測(cè)中的應(yīng)用[J].醫(yī)療裝備,2011,3(5):203-204.