牛蒡顆粒劑對糖尿病大鼠氧化應激、細胞凋亡的影響及糖尿病心肌病變的防治

劉長山 李 萍 王秀軍 柳 林 孫麗萍 劉海霞 明 義 劉 慧 丁穎超

(濰坊市人民醫院內分泌科，山東 濰坊 261041)

研究證實，葡萄糖誘導的活性氧簇(ROS) 導致的氧化應激是糖尿病心肌病(DCM)的重要發病機制〔1〕。研究發現細胞凋亡同樣參與了DCM發生發展的整個過程，但目前關于DCM過程中氧化應激與心肌細胞凋亡作用的研究報道甚少。本研究觀察中藥牛蒡對氧化應激和心肌細胞凋亡的影響及對DCM的保護作用及其作用機制。

1 材料與方法

1.1糖尿病動物模型的制備及實驗動物分組 健康雄性6周齡Wistar大鼠30只(由濟寧醫學院實驗動物中心提供)，體重180～200 g。適應性喂養大鼠1 w后，隨機取10只作為正常對照組，其余20只擬作為糖尿病觀察組，于左下腹腔按60 mg/kg體重注射鏈脲佐菌素(STZ)溶液，注射后72 h斷尾用羅氏血糖儀測血糖，血糖≥16.7 mmol/L為糖尿病動物模型建立。將20只模型大鼠隨機分為糖尿病組和牛蒡治療組,每組10只，各組間血糖值無差異。

1.2試劑 STZ購自美國Alexi公司。牛蒡購自山東天達生物制藥有限公司。丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒購自碧云天生物技術有限公司。Bcl-2、Bax免疫組化測定藥盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。H-7500透射電鏡,日本HITACHI公司。UV-260型分光光度計，日本島津公司。

1.3標本的處理及收集 牛蒡治療組灌胃給藥150 mg·kg-1·d-1，糖尿病對照組和正常對照組則用等容量生理鹽水1 ml·100 g-1·d-1灌胃干預。于實驗的第4、8、12、16周測定血糖，16 w時處死大鼠。期間糖尿病對照組大鼠死亡1只，正常對照組及牛蒡治療組無死亡。用10%水合氯醛按400 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠。取部分左室心肌組織制備心肌勻漿檢測MDA含量及SOD水平。常規石蠟切片，透明、復水，按1∶100比例稀釋的小鼠抗大鼠Bax和Bcl-2抗體，滴加生物素化羊抗小鼠IgG二抗工作液，加辣根過氧化物酶標記的卵白素工作液，DAB顯色。另取大鼠左心室組織 8～10塊，常規甲醛溶液固定進行HE染色，另取部分心肌組織經戊二醛固定，以備透射電鏡觀察。

2 結 果

2.1各組大鼠血糖變化 試驗前各糖尿病大鼠血糖均顯著高于正常對照組(P<0.01)，治療16 w結束時，糖尿病組及牛蒡治療組血糖與治療前比較無顯著差異(P>0.05)，兩組間無明顯差異(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血糖比較

2.2各組大鼠心肌組織MDA含量、SOD水平的變化 與正常對照組比較，糖尿病各組MDA含量均升高(P<0.01)，SOD水平均降低(P<0.01)；與糖尿病組比較，牛蒡治療組MDA含量降低(P=0.000)，SOD水平升高(P=0.000)。見表2。

表2 各組大鼠心肌組織SOD活性和MDA含量變化

2.3各組大鼠凋亡相關蛋白免疫組織化學染色結果 正常對照組大鼠心肌細胞Bcl-2蛋白明顯表達,糖尿病組心肌細胞Bcl-2蛋白表達減少，牛蒡治療組Bcl-2蛋白表達較糖尿病組增多。正常對照組大鼠心肌細胞Bax蛋白表達較弱，糖尿病組心肌細胞Bax蛋白表達明顯增多，牛蒡治療組Bax蛋白表達較糖尿病組減少。

2.4心肌組織光鏡HE染色觀察 正常對照組大鼠心肌細胞排列整齊，無心肌纖維的破壞，細胞間隙正常，心肌間質及微血管等結構正常；糖尿病組出現心肌細胞排列紊亂、腫脹，肌原纖維紊亂，心肌纖維間結締組織增多；牛蒡治療組心肌細胞排列輕度紊亂，心肌纖維間結締組織增生現象較糖尿病組有所減輕。

2.5心肌組織電鏡下超微結構觀察 糖尿病組表現為閏盤連接處部分心肌纖維出現肌絲減少、肌斷裂，心肌纖維內部分線粒體空泡樣變、髓樣變，線粒體嵴模糊，嵴斷裂，細胞核不規則,核固縮，核內染色質邊集等；牛蒡治療組顯示閏盤周圍線粒體病變不明顯，少數線粒體旁邊有小的空泡，線粒體嵴比較規整，部分線粒體嵴清晰，較糖尿病組有所減輕。

3 討 論

DCM是糖尿病常見的嚴重的慢性并發癥之一，是引起糖尿病心力衰竭的主要因素，也是糖尿病晚期死亡的主要原因。它是以心肌肥大、心肌纖維化、細胞水平鈣轉運缺陷、心肌收縮蛋白膠原形成和脂肪酸代謝異常等為特征的一種獨特的心肌病變〔2〕。

研究發現DCM的發生發展與血糖升高程度、持續時間〔3〕密切相關。長期高血糖環境下心肌組織中ROS產生增加，抗氧化酶SOD活性下降，機體對氧自由基的清除能力大大減弱，機體對氧自由基的清除能力大大減弱，這種動態失衡勢必造成體內大量ROS的有害蓄積，引起ROS的連鎖反應，從而加重了氧化應激，氧化應激引起心肌脂質過氧化損傷，對心肌細胞內包括蛋白質，脂類與核酸等生物大分子造成氧化損傷，導致生物膜溶解和細胞凋亡，引起心肌組織的結構和功能嚴重受損，進而導致DCM的發生〔4〕。

細胞凋亡是心肌細胞由肥大轉向衰竭的重要病理改變，近年來大量的研究發現，心肌細胞凋亡在DCM的發生與發展中起著重要作用〔5〕。

凋亡相關基因可分為凋亡促進基因和抑制基因兩種。這兩類基因相互作用的結果決定細胞是生存還是凋亡。抑制基因中最具代表性的是Bcl-2，它可以阻止細胞凋亡〔6〕。Bcl-2基因的同源基因之一是Bax基因，它的過度表達可拮抗Bcl-2的保護效應而使細胞趨于凋亡。

高血糖通過何種途徑導致細胞凋亡的確切機制尚不完全清楚。有研究發現，高血糖導致氧化應激與細胞凋亡密切相關，當外源性活性氧及細胞內ROS 生成增加、清除ROS能力下降和抗氧化能力減弱時可致細胞凋亡。氧化損傷引起細胞凋亡的可能機制：ROS損傷細胞中的DNA，除激活P53基因外，還引起多聚ADP核糖合成酶活化，耗竭輔酶Ⅰ(NAD)，消耗大量ATP，導致細胞凋亡。氧化應激誘導的與凋亡相關的基因除了與Bcl-2有關外，c-Myc和Fas-FasL也參與氧化應激誘導的細胞凋亡〔6〕。

本實驗提示高血糖通過增加心肌組織氧化應激而促進凋亡相關基因表達，誘導心肌組織細胞凋亡而參與DCM的發生發展。中藥牛蒡可能通過抑制心肌組織氧化應激、干預心肌組織細胞凋亡防治DCM的發生發展。

自日本人田川越等從牛蒡中獲得牛蒡苷以來，關于牛蒡化學活性物質的研究取得了重要進展，從其果實、莖葉和根中分別獲得30余種不同類型的天然化合物，并發現了多種重要的藥理和生理活性〔7〕。本實驗所用牛蒡采用天然牛蒡為原料，依據傳統中藥焙炒、煎煮的炮制方法結合現代生物提取技術，制成顆粒制劑。研究發現中藥牛蒡具有抑制氧化應激及心肌保護作用，而且中藥毒副作用極低，加上DCM病程遷延，這就決定其用藥治療的過程將是長期的甚至是終生的，藥物的副作用及費用均應考慮。

4 參考文獻

1Seager MJ,Singal PK,Orchard R,etal.Cardiac cell damage：a primary myocardial disease in streptozotocin-induced chronic diabetes〔J〕.Br J Exp Pathol,1984；65(5)：613-23.

2Malhotra A,Sanghi V.Regulation of contractile proteins in diabetic heart〔J〕.Cardiovasc Res,1997；34(1):34-40.

3Sambandam N,Abrahani MA,Craig S,etal.Metabolism of VLDL is increased in streptozotocin-induced diabetic rat hearts〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol,2000；278(6):H1874-82.

4Aneja A,Tang WH,Bansilal S,etal.Diabetic cardiomyopathy:insights into pathogenesis,diagnostic challenges,and therapeutic options〔J〕.Am J Med,2008；121(9):748-57.

5Fang ZY,Prins JB.Diabetic cardiomyopathy:evidence,mechanisms,and therapeutic implications〔J〕.Endocr Rev,2004；25(4):543-67.

6Kamimoto Y,Sugiyama T,Kihira T.etal.Transgenic mice overproducing human thioredoxin-1,an antioxidative and anti-apoptotic protein,prevents diabetic embryopathy〔J〕.Diabetologia，2010；53(9):2046-55.

7劉樹民，李玉潔，李淑蓮,等.牛蒡根抗衰老作用的實驗研究〔J〕.中醫雜志，2004；45(8)：617-8.