失交感神經支配與新骨形成及改建

王承勇， 林 海， 王 錦， 危紅英， 張德慶， 盧 萌， 陳偉輝

成骨細胞和破骨細胞的增殖、分化和生長受到多重調節作用機制的影響，除了受局部生長因子、細胞因子及細胞黏附分子的調節作用外，還受到自主神經系統的調節[1-4]。Bjurholm等研究表明，在骨組織中存在無髓交感神經[5]。交感神經對于骨組織改建和新骨形成中的作用越來越受到重視。較早的研究顯示，6-羥基多巴胺(6-HODA)等藥物可使沙鼠中耳泡中破骨細胞活性增強，表現為骨吸收作用，認為交感神經能通過調節破骨細胞活性，促進骨吸收[6]；但最近的研究則提出相反的觀點，Cherruau的研究從不同角度提出，交感神經興奮可以促進骨吸收，減少骨形成[7]。

交感神經通過分泌神經介質，包括兒茶酚胺類的β受體激動劑以及NPY等神經肽類物質，在骨改建和骨愈合中的作用是復雜和廣泛的，對于其作用機制還未完全明確。本實驗在建立去交感神經支配動物模型的基礎上，通過建立拔牙窩骨缺損模型，探討去交感神經支配對拔牙窩新骨形成和骨改建的調節作用。

1 材料與方法

1.1動物及儀器 5周齡清潔級雄性SD大鼠50只，體質量250～300 g[上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號：SCXK(滬)2003-0003]；多功能顯微鏡(AX84U-MCB，日本奧林巴斯株式會社)，切片機(2035，德國徠卡微系統有限公司)，并根據實驗要求自制手術器械若干。

1.2實驗方法 (1)失交感神經支配模型：具體建模方法參見文獻[8]。50只SD大鼠按5個時間點(1，3，7，14，21 d)分為5組，每組10只，其中2只為預實驗大鼠，未列入最后數據的統計分析。每組大鼠5只左側為頸上神經節切除術組(SCGx)，右側為假手術組(CG)；另5只左側為CG組，右側為SCGx組；SCGx組為實驗組，CG組為對照組。(2)拔牙窩骨愈合模型：10%水合氯醛300～350 mg腹腔注射麻醉，仰臥位，翻開口腔暴露上頜第一磨牙，分離牙齦，小刮匙挺出上頜第一磨牙，建立拔牙窩骨愈合模型。(3)不同時間點處死大鼠并行多聚甲醛內灌注，切取大鼠上頜骨部分，置入新鮮配制4%多聚甲醛，4 ℃低溫固定過夜。微波法上頜骨快速脫鈣，持續脫鈣直到大頭針可以無阻力穿透上頜骨。

1.3H-E染色檢測拔牙窩 常規H-E染色，顯微拍照(×100)。利用Image-Pro Plus6.0軟件對照片進行分析。選取拔牙窩區域作為興趣區域(AOI)，分析拔牙窩內組織情況。分為以下成分：血凝塊和血痂(blood clot and scab, BCAS)、未礦化組織(non-mineralized tissue, NMT)、編織骨(woven bone, WB)、板層骨(lamellar bone, LB)、新生骨組織(new bone, NB)、拔牙窩面積(T.Ar)、新骨面積(B.Ar)，單位均為像素(pixel)。骨組織形態計量學參數包括：

新骨面積：B.Ar(NB)=WB+LB，表示拔牙窩內新形成骨組織總和

骨體積分數：BV/TV=B.Ar/T.Ar×100%，表示既定拔牙窩內新骨形成面積與拔牙窩面積之比

各組分分數(以BCAS為例)：BCAS/T.Ar×100%，表示拔牙窩內各組成成分與拔牙窩面積之比

2 結 果

2.1各組拔牙窩組織形態學 (1)1 d可見拔牙窩表面大量血性滲出物覆蓋，伴壞死及細菌感染。拔牙窩內血凝塊形成，少量炎癥細胞浸潤，拔牙窩骨壁周圍可見殘留牙周膜以及纖維素性滲出物。未見新生血管形成，篩狀板周圍少量多核破骨細胞形成，伴少量骨吸收陷窩。實驗組與對照組之間差別無統計學意義。(2)3 d可見拔牙窩近牙槽嵴部分有大量肉芽組織形成，血凝塊機化，毛細血管形成，拔牙窩中部及底部可見明顯纖維化過程，成纖維細胞生長活躍，血管數目較頂部肉芽組織少，拔牙窩底及部分樣本拔牙窩壁形成纖維性骨痂，少量編織骨形成，可見破骨細胞及骨吸收陷窩增多。對照組成骨細胞及編織骨少于實驗組。(3)7 d可見拔牙窩纖維細胞生長活躍，血凝塊被完全機化，拔牙窩整體充滿大量成熟的纖維組織，毛細血管相對生長活躍，可見明顯編織骨的形成，局部可見骨化現象。側壁出現骨吸收陷窩，篩狀板因吸收表現為部分連續性中斷，對照組毛細血管相對較少。(4)14 d可見纖維性骨痂充填牙槽窩，纖維組織成熟，成骨活動明顯。新骨形成部位周圍大量成骨細胞以及毛細血管分布，骨小梁結構明顯，部分底部骨組織形成板層骨形態。對照組結構松散，排列欠規則。(5)21 d可見骨小梁生長至牙槽嵴頂，骨組織趨于成熟，但骨小梁結構較無序。骨小梁周圍骨髓組織形成，血管數量明顯減少。板層骨結構對照組明顯少于實驗組(圖1)。

A～E：實驗組；a～e：對照組. A、a：1 d；B、b：3 d；C、c：7 d；D、d：14 d；E、e：21 d. ：血凝塊和血痂；：牙周膜；：骨髓；：纖維性骨痂；：編織骨；：板層骨；：炎癥細胞；：血管.

2.2各指標統計學分析結果

2.2.1BV/TV 在術后早期，實驗組新骨形成均較對照組快，表現為新骨形成量上的差異，在達到3周之后，新骨形成在量的方面，二者之間的差別無統計學意義，顯示新骨形成已經趨近于穩定的狀態(圖2)。

2.2.2拔牙窩各組成成分 1 d時間點，拔牙窩內由BCAS和NMT(主要是殘余牙周膜)兩部分組成，組成比例基本一致，差別無統計學意義。3 d時間點，隨著BCAS機化的進程，NMT開始明顯增多，但BCAS以及NMT在實驗組與對照組之間差別無統計學意義。有少量新生的WB出現，實驗組多于對照組，差別有統計學意義。7 d時間點，NMT在實驗組和對照組中差別有統計學意義，反證包括編織骨和板層骨在內的NB之間，實驗組量大于對照組。在NB中，WB之間差別無統計學意義，而LB差別則有意義。14 d時間點，NB及LB的形成上實驗組均多于對照組；21 d時間點，NB形成上實驗組與對照組之間的差別無統計學意義，但是在NB中，實驗組與對照組在WB、LB比例之間的差別均有統計學意義(表1)。

SCGx:頸上神經節切除術組;CG:假手術組. n=8. 與CG組比較,☆：P<0.05.

3 討 論

骨組織的改建是一個動態平衡過程，骨和骨膜上分布著豐富的交感神經，而交感神經來源的信號對成骨細胞以及破骨細胞的生長與分化起著特殊的刺激作用。神經系統功能紊亂往往可以直接影響骨形成與改建，表現為局部骨質減少、病理性骨折、骨折愈合異常、拔牙后牙槽骨吸收和過量骨痂形成等[4,9-10]。

表1 各組拔牙窩構成

在之前的研究中，Sherman等利用6-HODA在沙鼠上進行試驗表明，失交感神經支配可以導致骨吸收明顯增加，新骨形成減弱[11]。另一項研究也表明，在失交感神經支配的下頜骨骨膜上破骨細胞增加[6]。其觀點支持交感神經的作用是促進骨形成，降低骨吸收。

另一方面，Togari的研究指出，交感神經末梢對骨組織中的成骨細胞以及破骨細胞均產生影響[12]；且近年來的研究指出，交感神經活動對骨形成與改建有抑制作用，其作用通過活化成骨細胞上的β-腎上腺素受體，減少骨基質形成[13-15]，又通過活化成骨細胞β-腎上腺素受體，增加了RANKL的表達，后者可以增強破骨細胞活性和促進破骨細胞形成增強骨吸收作用。Okada等研究發現，應用心得安這類β-腎上腺素受體抑制劑可以抑制牙周炎大鼠骨吸收，減少牙槽嵴的骨喪失[16]。近年來的研究均表明交感神經作用可以抑制骨形成。

在本實驗中，各時間段拔牙窩骨形成與改建過程在大體標本以及形態學表現上同Sato等的研究類似[17]，僅在同一時間點的表現上略有不同。在拔牙術后3，7，14 d時間點上，實驗組的新骨形成相對于對照組差別具有統計學意義，即失交感神經側牙槽窩新骨骨量大于交感神經支配側骨量，失交感神經支配對新骨形成起到促進作用。術后21 d時間點，2組之間差別已無統計學意義，新骨形成趨于穩定，這說明在抑制交感神經之后，可以更快地達到骨形成與骨吸收的平衡點。Haug等的研究從另一方面提出交感神經與感覺神經在神經生長上存在著相互競爭的作用，選擇性的切斷一種神經支配會導致另一種神經過度生長，繼而通過增強感覺神經對骨形成的促進作用從而促進新骨形成[18]。

本實驗針對新生骨組織中不同的骨質成分進行單獨分析發現，在術后3～21 d的骨愈合早期，新生骨組織變化具有特別意義，不僅表現為新骨形成，并在此過程中伴隨著骨改建和骨成熟。拔牙術后3～14 d時間點上不僅表現為總新骨形成差異，而且在成熟的板層骨形成差別也具有統計學意義。這個差異在21 d最為明顯(P<0.01)。這說明失交感神經支配對于新骨形成不僅表現在促進骨形成，同時也促進了新骨組織的成熟，從而證實交感神經不僅抑制骨形成，也抑制骨改建，延遲了骨成熟，對于拔牙窩的完全骨愈合起到抑制作用。

綜上所述，失交感神經支配不僅僅對骨形成具有促進作用，對骨改建和新骨成熟也具有顯著的意義。

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