電暈電場(chǎng)輔助5－Fu作用HeLa細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究

李 光，周海越，孫迎春

（1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130117；2.東北師范大學(xué)物理學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130024）

0 引言

在自然界環(huán)境中電磁場(chǎng)以多種形式普遍存在于人們的生活中，雷電、各種無(wú)線信號(hào)、家用電器等都產(chǎn)生一定的電磁場(chǎng).正常情況下，人體已經(jīng)適應(yīng)普遍存在的電磁場(chǎng)，但外加高強(qiáng)度的電磁場(chǎng)對(duì)生物會(huì)有一定的影響.經(jīng)一定強(qiáng)度高壓芒刺靜電場(chǎng)預(yù)處理的大豆種子的發(fā)芽率明顯提高［1］，并能有效提高玉米種子的發(fā)芽率［2］.一定強(qiáng)度范圍的高壓芒刺靜電場(chǎng)作用于實(shí)驗(yàn)鼠，能夠有效激發(fā)免疫細(xì)胞表面分子的表達(dá)［3］，抑制人肝癌細(xì)胞SMMC7721的生長(zhǎng)［4］.

多年來(lái)化療是治療腫瘤的一個(gè)主要方法，但這種方法不能起到藥到病除的效果.化療的主要障礙是受藥物濃度及藥物毒性的限制，難以有足夠高濃度的化療藥物進(jìn)入腫瘤內(nèi)部，若大大提高用藥量，則副作用會(huì)極大增加，使人難以承受.并且，腫瘤細(xì)胞內(nèi)自然表達(dá)耐藥基常產(chǎn)生耐藥性［5］.因此，很多研究人員嘗試提高化療藥物的增敏性.已有研究表明，一定的電場(chǎng)會(huì)使細(xì)胞膜脂質(zhì)雙分子層形成瞬時(shí)微孔，能夠瞬時(shí)增加細(xì)胞膜的通透性和膜的電導(dǎo)率［6］.當(dāng)電場(chǎng)取消后，微孔會(huì)關(guān)閉，不會(huì)對(duì)細(xì)胞造成影響.電場(chǎng)中的腫瘤細(xì)胞膜出現(xiàn)的微孔能夠增強(qiáng)細(xì)胞膜的通透性，即增強(qiáng)了細(xì)胞的吞噬能力，減小了細(xì)胞膜對(duì)外來(lái)分子的排斥，也就是說(shuō)，電場(chǎng)強(qiáng)迫抗癌藥物通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，從而有效提高化療藥物的細(xì)胞毒性［7－8］，另外，當(dāng)給細(xì)胞施加一定強(qiáng)度的電場(chǎng)時(shí)，由于熱效應(yīng)，細(xì)胞內(nèi)的溫度會(huì)明顯升高，這有利于抑制腫瘤細(xì)胞內(nèi)耐藥基因的表達(dá)［9］，從而降低腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性.本文以體外傳代培養(yǎng)的Hela細(xì)胞為對(duì)象，探討了電暈電場(chǎng)配合化療藥物5－Fu對(duì)人宮頸癌細(xì)胞HeLa的殺傷作用，發(fā)現(xiàn)電暈電場(chǎng)輔助化療藥物5－Fu能夠有效地殺傷體外培養(yǎng)的HeLa.

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

細(xì)胞培養(yǎng)：HeLa細(xì)胞（東北師范大學(xué)細(xì)胞與遺傳研究所提供）培養(yǎng)在37℃和5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)基為質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640（Invitrogen Corporation）.取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，進(jìn)行計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×104個(gè)／mL，分別以1和0.1mL／孔接種于6孔和96孔培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng).

分組：所有細(xì)胞分為Ⅰ和Ⅱ兩部分（每部分為不同電壓梯度處理組）.Ⅰ為單純電場(chǎng)處理部分，Ⅱ?yàn)殡妶?chǎng)聯(lián)合5－Fu處理部分.Ⅱ組細(xì)胞于次日加入5－Fu，最終濃度為1μg／mL，在培養(yǎng)箱培養(yǎng)3h后，兩組細(xì)胞同時(shí)接受電場(chǎng)處理.

1.2 電場(chǎng)裝置及設(shè)定的場(chǎng)強(qiáng)梯度

圖1為電暈電場(chǎng)裝置.其中：A為控制開(kāi)關(guān)；B為靜電高壓電源（0～250kV）；C為Q3－V型高壓靜電表（量程為0～30kV）.上下極板均采用長(zhǎng)方形的鋁板，上極板固定等長(zhǎng)度、等間距排列的金屬釘作為芒刺，以產(chǎn)生電暈電場(chǎng)，下極板接地，芒刺尖端與下極板間距離為2.5cm，電場(chǎng)處理細(xì)胞時(shí)將細(xì)胞培養(yǎng)板放在下極板正中.兩極板面積遠(yuǎn)大于培養(yǎng)板面積，故細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)部電場(chǎng)可視為均勻電場(chǎng)，且可忽略邊緣效應(yīng).電壓梯度為0，2，6，10，14kV，處理時(shí)間為30min／d，連續(xù)處理4d.

圖1 電場(chǎng)裝配圖

1.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性

將Ⅰ和Ⅱ組在96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)細(xì)胞，每孔加入20μL MTT（5mg／mL），繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄去上清液，每孔再加入150μL DMSO，充分溶解后，用酶標(biāo)儀（λ490nm）測(cè)定吸光度（A值），每個(gè)電場(chǎng)作用樣本設(shè)8個(gè)復(fù)孔.繪制吸光度曲線，用抑制率＝［（對(duì)照組A值－實(shí)驗(yàn)組A值）÷對(duì)照組A值］×100%來(lái)計(jì)算電場(chǎng)對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率.

1.4 FCM檢測(cè)細(xì)胞死亡率

用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%的胰蛋白酶消化6孔培養(yǎng)板中細(xì)胞，離心，PBS洗滌2次，加入0.05mg／mL的150μL PI染液，4℃避光染色30min.用FACScan流式細(xì)胞儀（美國(guó)B－D公司）檢測(cè)細(xì)胞死亡率，計(jì)算特異陽(yáng)性細(xì)胞百分比.

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用非配對(duì)Student't檢驗(yàn)，Origin軟件處理數(shù)據(jù).

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 單純電暈電場(chǎng)對(duì)HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，單純電暈電場(chǎng)對(duì)HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)的影響具有雙向性（見(jiàn)表1和圖2）.與對(duì)照組相比，在U≤2kV時(shí)，電場(chǎng)的作用促進(jìn)了細(xì)胞的生長(zhǎng)，在2kV電壓作用下，細(xì)胞活性是對(duì)照組的1.27倍，抑制率是為－27.0%，而在U≥6kV時(shí)，電暈電場(chǎng)對(duì)HeLa生長(zhǎng)起到了抑制作用，在電暈電場(chǎng)電壓達(dá)到14kV時(shí)，細(xì)胞HeLa的活性?xún)H是對(duì)照組的54.9%，抑制率高達(dá)45.3%（P＜0.01），而且隨著電場(chǎng)電壓的增加，對(duì)HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制程度增強(qiáng).

2.2 電暈電場(chǎng)聯(lián)合5－Fu對(duì)HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)電暈電場(chǎng)聯(lián)合5－Fu作用的HeLa細(xì)胞結(jié)果見(jiàn)表2和圖3.各強(qiáng)度電場(chǎng)聯(lián)合藥物處理組致使HeLa細(xì)胞的死亡率均多于單純電場(chǎng)組（見(jiàn)表1）和單純加藥組（見(jiàn)表2中0kV組），且細(xì)胞死亡率隨電場(chǎng)強(qiáng)度增加而增加，與單純電場(chǎng)處理組不同的是細(xì)胞活性不具有刺激生長(zhǎng)和抑制生長(zhǎng)的雙向性.

表1 單純電暈電場(chǎng)對(duì)HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)抑制影響（，n＝8）

表1 單純電暈電場(chǎng)對(duì)HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)抑制影響（，n＝8）

電壓／kV抑制率／%0—2－27.06 5.610 22.41445.3

表2 FCM檢測(cè)電暈電場(chǎng)聯(lián)合5－Fu作用HeLa細(xì)胞的死亡率

圖2 電場(chǎng)強(qiáng)度與A值關(guān)系

圖3 場(chǎng)強(qiáng)與電暈電場(chǎng)聯(lián)合5－Fu作用后細(xì)胞死亡率關(guān)系

3 結(jié)論

本文以體外培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞為對(duì)象，檢測(cè)了電暈電場(chǎng)與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用及單獨(dú)用藥對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)的影響.結(jié)果表明：5－Fu聯(lián)合電暈電場(chǎng)共同作用體外培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞時(shí)，HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)收到極大的抑制，細(xì)胞活性降低，而細(xì)胞死亡率增加，5－Fu聯(lián)合電暈電場(chǎng)共同作用對(duì)細(xì)胞的殺傷力既高于單純電暈電場(chǎng)的作用也高于單純5－Fu的作用.提示電暈電場(chǎng)與抗癌藥物聯(lián)合使用時(shí)能產(chǎn)生比抗癌藥物單獨(dú)作用時(shí)更大的細(xì)胞毒性.

［1］孫迎春，張羽，李麗雅，等.高壓芒刺靜電場(chǎng)預(yù)處理對(duì)大豆種子發(fā)芽的影響［J］.東北師大學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2005，37（1）：54－56.

［2］孫迎春，丁會(huì)，徐麗紅，等.高壓芒刺靜電場(chǎng)預(yù)玉米種子發(fā)芽影響的實(shí)驗(yàn)研究［J］.東北師大學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2006，38（1）：84－86.

［3］孫迎春，劉曉冬，楊秀蘭，等.高壓芒刺靜電場(chǎng)對(duì)小鼠LFA－1和ICAM－1表達(dá)的影響［J］.分子科學(xué)學(xué)報(bào)，2005，21（5）：46－50.

［4］孫迎春，嚴(yán)羚瑋，金光輝，等.高壓芒刺靜電場(chǎng)對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC7721生長(zhǎng)的影響［J］.中國(guó)醫(yī)學(xué)物理學(xué)雜志，2005，22（1）：391－392.

［5］孫敬儒，王子淑，劉一勇，等.電穿孔誘發(fā)細(xì)胞凋亡和提高抗癌藥物細(xì)胞毒性的研究［J］.四川大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2002，39：170－174.

［6］WEAVER J C.Electroporation：a dramatic，nonthermal electric field phenomenon［C］.Proceedings of the first world congress for electricity and magnetism in Biology and medicine.Lake Buena Vista，F(xiàn)lorida：Academic Press，1992：1－89.

［7］CEMAZAR M，MIKLAVCIC D，SCANCER J，et al.Increased platinum accumulation in SA－1tumor cells after in vivo electrochemotherapy with cisplatin［J］.British Journal of Cancer，1999，79（9／10）：1386－1391.

［8］SAUER H，PUTZ V，F(xiàn)ISCHER K，et al.Increased doxorubicin uptake and toxicity in multicellular tumor spheroids treated with DC electrical fields［J］.British Journal of Cancer，1999，80（8）：1204－1213.

［9］宋燕爽，劉洪隱，王立梅，等.加熱能明顯抑制腫瘤細(xì)胞多藥耐藥基因的表達(dá)［J］.中國(guó)腫瘤臨床，1996，23（5）：375.