基于rDNA部分序列的亞洲小車蝗遺傳多樣性分析

韓海斌，周曉榕，龐保平，常 靜

（內蒙古農業大學農學院，內蒙古 呼和浩特 010019）

0 引言

亞洲小車蝗Oedaleus asiaticus（Bienko）是我國北方蝗蟲的優勢種［1］，同時也是內蒙古草原蝗蟲的優勢種.亞洲小車蝗在內蒙古的主要分布地區為錫林郭勒盟中西部至鄂爾多斯市東部的典型草原和荒漠草原地區，發生數量是所有蝗蟲的50%～60%，嚴重的時候甚至可以達到90%以上，是草原上最嚴重的成災蝗蟲［2］.亞洲小車蝗發生為害早、且發生數量大的特點對受害作物危害嚴重，可導致受害作物減少50%以上的產量，甚至顆粒無收［3］.亞洲小車蝗對草原的危害更為嚴重，可破壞草原的自然生態平衡，使草場退化、沙化的速度加快，目前，已經被認定為草原退化的指示災害種群［4］.因此，人們對亞洲小車蝗的遺傳多樣性進行了大量研究［5－12］.

核糖體DNA（rDNA）是目前廣泛使用的細胞核DNA分子標記，其編碼區的序列高度保守，間隔區的進化速度大約與物種形成的進程相仿［13－15］.rDNA中的內轉錄間隔區（rDNA－ITS）序列的進化速率較快，可以提供較豐富的變異位點和信息位點［16］.前人已經對許多物種的ITS序列做過研究［17］.王莉萍等對美洲斑潛蠅Liriomyza sativae Blanchard不同地理種群的ITS1序列進行了分析研究［16］；李正西和沈佐銳（2002）對松毛蟲赤眼蜂Trichogramma dendrolimi Matsumura的不同地理種群的ITS2序列進行了研究分析［18］，探討了它們之間的系統發生關系.

本文對內蒙古地區15個地點亞洲小車蝗的一段rDNA序列進行了擴增、測序和比較分析.希望從分子水平闡述同種蝗蟲不同自然種群遺傳分化的機制，為其利用與綜合防治提供遺傳學方面的依據，從而為重災蝗區蝗蟲的防治工作提供基礎資料.

1 材料與方法

1.1 蝗蟲樣本

本實驗所用的亞洲小車蝗15個不同地點的樣本均為內蒙古的自然種群（見表1），選取成蟲個體進行捕捉，然后用養蟲籠活體帶回實驗室中，用液氮速凍處理后放入－40℃的冰箱中保存.每個地理種群取5只蝗蟲進行測序.

表1 亞洲小車蝗采集信息

1.2 蝗蟲基因組DNA提取

取亞洲小車蝗后足股節（＜50g），研磨成粉狀后放入離心管中備用.使用天根dp304動物基因組DNA提取試劑盒對研磨成粉的樣本進行DNA的提取，放入－40℃冰箱中備用.

1.3 PCR擴增及產物檢測

PCR擴增體系總體積為50μL，其中2μL模板DNA，5μL 10×PCR Buffer，4μL的dNTP mix，2μL引物（10μmol／L），0.6μL TaKaRa Taq（5U／μL）（大連寶生物工程有限公司），最后用ddH2O補至50μL.

引物序列參考文獻［15］，由上海生工生物工程股份有限公司合成（見表2）.

表2 引物序列

PCR反應用BIO－RAD PCR儀進行，反應程序為：95℃預變性3min；95℃變性1min—55℃退火1min—72℃延伸1.5min，35個循環；72℃延伸10min；4℃保存.

通過ADVANCE水平電泳儀，選用2%的瓊脂糖凝膠對PCR產物進行電泳檢測.

1.4 產物序列測定及序列分析

委托上海生工生物工程股份有限公司對產物進行測序.序列測定的結果與GenBank中已知的蝗蟲：中華稻蝗Oxya chinensis formosana（登錄號為F385193.1），Chorthippus parallelus（登錄號為AY585651.1），小稻蝗Oxya hyla intricata（登錄號為 AF385196.1）、日本稻蝗Oxyajaponica japonica（登錄號為AF385194.1），臺灣小稻蝗Oxyapodisma（登錄號為AF385195.1）的rDNA序列進行比對.用Clustal X軟件對rDNA序列進行測定；用MEGA 4.0軟件［19］對序列特征和遺傳距離進行計算；使用DNASP 5.10.1［20］和Excel軟件計算單倍型多樣性（Hd）、種群遺傳分化系數（FST）、基因流（Nm）、核苷酸多樣性（Pi）、平均核苷酸差異數（K）；采用Distance軟件計算地理距離；使用TFPGA進行Mantel檢測；使用TCS對單倍型進行分析并構建網絡圖［21］.

2 結果與分析

2.1 序列堿基組成分析

測序結果經與GenBank中已知蝗蟲序列的比較、剪切得到部分5.8S、全部ITS2和部分28S共288bp的rDNA序列.測試的15個種群的75個個體序列中，共有19個變異位點，其中包括16個堿基的替換（5個轉換和11個顛換）和3個堿基插入，占所測序列的6.60%；19個多態性位點中包括6個單變異多態性位點和13個簡約信息位點.序列中T、A、C和G堿基平均含量分別為19.9%，27.6%，19.3%和33.2%，G＋C（60.8%）含量高于A＋T（39.2%）含量，與已知GenBank中5種蝗蟲的對比序列堿基組成特點基本一致（平均堿基含量G＋C為63.8%，A＋T為36.2%）.

2.2 亞洲小車蝗種群內遺傳多樣性分析

15個亞洲小車蝗種群的遺傳多樣性指數見表3.結果表明，15個種群的單倍型多樣性（Hd）在0.000～0.800之間，四子王旗和烏拉特中旗種群最高，察右后旗、巴林右旗和達茂旗種群最低；平均核苷酸差異數（K）在0.000～8.000之間，其中正鑲白旗種群最高，察右后旗、巴林右旗和達茂旗種群最低；核苷酸多樣性（Pi）在0.0000～0.0280之間，正鑲白旗種群最高，察右后旗、巴林右旗和達茂旗種群最低.說明在察右后旗、巴林右旗和達茂旗種群中沒有基因變異發生，四子王旗和烏拉特中旗種群變異產生的單倍型最多，正鑲白旗種群發生的變異位點最多.

2.3 亞洲小車蝗種群間遺傳多樣性分析

由表3可知，亞洲小車蝗15個地理種群的遺傳分化系數（FST）為0.0506～0.4028，正鑲白旗種群檢測到的FST值最小，烏拉特中旗種群檢測到的FST值最大，均值為0.1495；基因流（Nm）在0.2312～5.9336之間，固陽種群檢測到的值最大，察右后旗、巴林右旗和達茂旗種群檢測到的值最小，均值為1.9880.結果表明，15個種群之間存在一定的基因交流和遺傳分化.

表3 內蒙古亞洲小車蝗15個地理種群遺傳多樣性指數

2.4 單倍型分析

本文的75條序列中鑒定出8個單倍型（見表4），其中有3個共享單倍型和5個獨享單倍型.Hap1被除烏拉特中旗種群以外的其他14個種群所共享，頻率為0.6800；Hap2被固陽種群與烏拉特中旗種群共享，頻率為0.0400；Hap3為克什克騰旗種群等9個種群所共享，頻率為0.2133；其他5個單倍型分別被烏拉特中旗種群、四子王旗種群、阿左旗種群和正鑲白旗種群獨享，頻率均為0.0133.四子王旗種群共有4個單倍型，在15個種群中最多；其次為烏拉特中旗種群，有3個單倍型；察右后旗、巴林右旗和達茂旗種群均只檢測出1個單倍型，結果表明在各種群內存在一定的遺傳分化.

由單倍型網絡圖（見圖1）可知，由四子王旗種群和正鑲白旗種群獨享的單倍型Hap5和Hap8分離出其他單倍型而存在，說明四子王旗種群和正鑲白旗種群較其他種群變異程度大.Hap5經6次變異形成Hap8，Hap6突變3次形成Hap3，Hap4和Hap7經過4次突變均可形成Hap2.

表4 各單倍型頻率及在種群中的分布

2.5 遺傳距離和地理距離的相關性分析

使用TFPGA軟件對亞洲小車蝗15個種群的遺傳距離和地理距離進行Mantel測定，結果見圖2、表5，回歸方程為y＝－8045.4 x＋565.8，相關系數r＝－0.1554（P＝0.8080＞0.05）.由此可見，本實驗研究的亞洲小車蝗15個種群間的遺傳距離與其地理距離間無顯著的相關關系.

圖1 單倍型網絡圖

圖2 內蒙古亞洲小車蝗15個種群的遺傳距離與地理距離間的回歸分析

3 討論

本文測定的rDNA的288bp序列中G＋C含量高于A＋T含量，與GenBank中已知蝗蟲的rDNA序列的堿基組成一致，但是與赤眼蜂［18］、褐飛虱、白背飛虱、灰飛虱［22］、米爾頓姬小蜂［23］的rDNA序列的堿基組成相反，與亞洲小車蝗線粒體基因［24］的堿基組成也相反，說明不同物種之間的rDNA序列堿基組成存在差異，且同一物種不同基因的堿基組成同樣存在差異.

種群遺傳分化系數FST是種群間遺傳分化的重要指標.Wright指出，FST＜0.05，說明種群間分化很弱；0.05＜FST＜0.15，表示種群中等分化；0.15＜FST＜0.25，表示種群遺傳分化較大［25］.本文中FST平均值為0.1495，說明15個種群間的遺傳分化處于中等水平，群體中有14.95%的變異來自種群間，而有85.05%的變異來源于不同個體之間，個體間的變異大于種群間變異，這與李東偉等［5］運用RAPD和韓海斌等［12］運用微衛星標記對不同地點亞洲小車蝗遺傳多樣性研究的結果相似.

Whitlock和Mccauley認為，種群間基因相互交流的增加會導致種群間遺傳分化的減小［26］，所以，基因流Nm的存在是影響種群間遺傳分化的重要因素；Slatkin認為，種群間的基因流可以阻止完全的基因固定和遺傳分化［27］.本文中Nm平均值為1.9880（1＜Nm＜4），15個種群間基因交流處于中等水平.

本文的研究結果表明，內蒙古15個亞洲小車蝗種群的遺傳距離與地理距離無顯著相關性，這一結果與任竹梅等 對不同區域日本稻蝗Cytb基因序列和高書晶等 對亞洲小車蝗mtDNA ND1基因序列的研究結果一致.造成這一結果的原因可能是，本文所選的rDNA序列在遺傳上相對較為保守，進化較慢，在不同地理區域的亞洲小車蝗間沒有達到足夠的變異；也可能是亞洲小車蝗的遷移能力較強，在不同地理種群間存在較強的基因交流.這一推論符合本實驗對基因流的研究結果.李東偉等［5］和韓海斌等［12］運用RAPD和微衛星標記對不同地點亞洲小車蝗遺傳多樣性研究的結果顯示，不同地點的亞洲小車蝗種群的遺傳距離與地理距離具有顯著的相關性，說明單一的基因序列所涵蓋的信息量難以實際反應遺傳多樣性的全部規律［5，12］.因此，在下一步的研究中，應該增加研究內容所涵蓋的信息量和樣本量，對分子系統學的研究進行更深入的探討.

［1］張龍，嚴毓驊，王貴強，等.蝗蟲微孢子蟲病田間流行的初步調查［J］.草地學報，1995，3（3）：223－229.

［2］陳素華，烏蘭巴特爾，吳向東.內蒙古草地蝗蟲生存與繁殖對氣候變化的響應［J］.自然災害學報，2007，16（3）：66－69.

［3］許富禎，孟正平，郭永華，等.烏蘭察布市農牧交錯區亞洲小車蝗發生與防治［J］.內蒙古農業科技，2005，（7）：384－387.

［4］KANG L，CHEN Y L.Dynamics of grasshopper communities under different grazing intensities in Inner Mongolia steppes［J］.Entomologia Sinica，1995（2）：265－281.

［5］李東偉，高書晶，龐保平，等.內蒙古地區亞洲小車蝗不同地理種群的 RAPD分析［J］.昆蟲知識，2010，47（3）：472－478.

［6］高書晶，李東偉，劉愛萍，等.亞洲小車蝗不同地理種群遺傳多樣性的等位酶分析［J］.生態學雜志，2010，29（10）：1967－1972.

［7］高書晶，韓靖玲，劉愛萍，等.亞洲小車蝗和黃脛小車蝗不同地理種群的RAPD遺傳分化研究［J］.華北農學報，2011，26（2）：94－100.

［8］高書晶，李東偉，劉愛萍，等.不同地理種群的亞洲小車蝗mtDNA COⅠ基因序列及其相互關系［J］.草地學報，2011，19（5）：846－851.

［9］高書晶，劉愛萍，韓靜玲，等.不同地理種群的亞洲小車蝗mtDNA ND1基因序列及其相互關系［J］.應用昆蟲學報，2011，48（4）：811－819.

［10］邰麗華，賈建宇，王塔娜，等.內蒙古中東部地區亞洲小車蝗3個種群的遺傳多樣性分析［J］.華北農學報，2011，26（1）：122－126.

［11］BERTHIER K，LOISESU A，STREIFE R，et al.Eleven polymorphic microsatellite markers for Oedaleusdecorus（Orthoptera：Acrididae），an endangered grasshopper in Central Europe［J］.Molecular Ecology Resources，2008（8）：1363－1366.

［12］韓海斌，周曉蓉，龐保平，等.內蒙古亞洲小車蝗種群遺傳多樣性的微衛星分析［J］.昆蟲學報，2013，56（1）：79－87.

［13］張仁利，耿藝介，黃達娜，等.深圳市白紋伊蚊rDNA－ITS2區克隆及SNP分析［J］.中國熱帶醫學，2007，7（1）：8－11.

［14］MILLER B R，CRABTREE M B，SAVAGE H M.Phylogeny offourteen Culex mosquito species，including the Culex pipiens complex，inferred from the internal transcribed spacers of ribosomal DNA［J］.Insect Molecular Biology，1996，5（2）：93－107.

［15］JI Y J，ZHANG D X，HE L J.Evolutionary conservation and versatility of a new set of primers for amplifying the ribosomal intermal transcribed spacer（ITS）regions in sects and other invertebrates［J］.Molecular Ecology Notes，2003，3（4）：581－585.

［16］王莉萍，杜予州，何雅婷，等.不同地理種群美洲斑潛蠅及近緣種的rDNA－ITS1序列分析和比較［J］.昆蟲學報，2007，50（6）：597－603.

［17］唐伯平，周開亞，宋大祥.核rDNA ITS區序列在無脊椎動物分子系統學研究中的應用［J］.動物學雜志，2002，37（4）：67－73.

［18］李正西，沈佐銳.赤眼蜂分子鑒定技術研究［J］.昆蟲學報，2002，45（5）：559－566.

［19］KUMAR S，TAMURA K，NEI M.MEGA3：integrated software for molecular evolutionary genetics analysis and sequence alignment［J］.Briefings in Bioinformatics，2004，5（2）：150－163.

［20］ROZAS J，SáNCHEZ－DELBARRIO J C，MESSEGUER X，et al.DnaSP，DNA polymorphism analyses by the coalescent and other methods［J］.Bioinformatics，2003，19（18）：2496－2497.

［21］CLEMENT M，POSADA D，CRANDALL K A.TCS：a computer program to estimate gene genealogies［J］.Molecular ecology，2000，9（10）：1657－1659.

［22］劉玉娣，林克劍，韓蘭芝，等.基于rDNA ITS1和ITS2序列的褐飛虱、白背飛虱和灰飛虱的分子鑒定［J］.昆蟲學報，2009，52（11）：1266－1272.

［23］黃蓬英，廖富榮，林玲玲，等.米爾頓姬小蜂rDNA ITS1和ITS2的序列分析及其分子鑒定［J］.應用昆蟲學報，2012，49（2）：448－453.

［24］MA C，LIU C X，YANG P C，et al.The complete mitochondrial genomes of two band－winged grasshoppers，Gastrimargus marmoratus and Oedaleus asiaticus［J］.BMC Genomics，2009，10：1－12.

［25］WRIGHT S.Evolution and the genetics of populations（Vol.4）：variability within and among natural populations［M］.Chicago and London：University of Chicago Press，1978.

［26］WHITLOCK M C，MCCAULEY D E.Indirect measures of gene flow and migration：FST≠1／（4 Nm＋1）［J］.Heredity，1999，82：117－125.

［27］SLATKIN M.Gene flow and the geographic structure of natural population［J］.Science，1987，236：787－792.

［28］任竹梅，馬恩波，郭亞平.不同區域日本稻蝗Cytb基因序列及相互關系［J］.山西大學學報，2002，25（3）：244－248.