高效液相色譜-串聯質譜法測定艾瑞昔布片中艾瑞昔布的含量

李飛高，劉西哲，盧彥芳，趙曉娟，張志清*

(1.河北醫科大學第二醫院藥劑科，河北 石家莊 050000；2.河北醫科大學第三醫院藥劑科，河北 石家莊 050051)

·論著·

高效液相色譜-串聯質譜法測定艾瑞昔布片中艾瑞昔布的含量

李飛高1，劉西哲2，盧彥芳1，趙曉娟1，張志清1*

(1.河北醫科大學第二醫院藥劑科，河北 石家莊 050000；2.河北醫科大學第三醫院藥劑科，河北 石家莊 050051)

目的建立測定艾瑞昔布片劑中艾瑞昔布的高效液相色譜-串聯質譜(liquid chromatography-mass sepectrometry，LC-MS/MS)含量測定方法。方法樣品經甲醇-水(80∶20,V/V)提取，0.22μm微孔濾膜濾過后采用LC-MS/MS法測定其中艾瑞昔布的含量。色譜柱為Waters Symmetry R C18(3.5μm,2.1mm×100mm)，流動相為乙腈-水，梯度洗脫；離子源為電噴霧離子化源(ESI源)，離子源溫度為550 ℃，以多反應監測方式分別監測離子對m/z 370.2～278.2(艾瑞昔布)和m/z 346.1～198.0(內標奧美拉唑)。結果艾瑞昔布的監測濃度在31.83～509.34μg/L范圍內與內標的峰面積比值呈良好線性關系(r=0.997 6)；平均加樣回收率在95.6%～103.4%范圍內，相對標準差均小于6.1%(n=9)。結論該方法快速、靈敏，結果準確，適用于艾瑞昔布片劑的質量控制。

色譜法，高壓液相；串聯質譜法；艾瑞昔布

10.3969/j.issn.1007-3205.2014.03.001

艾瑞昔布(imrecoxib)為環氧化酶2(cyclooxygehase-2,COX-2)選擇性抑制劑，于2011年5月獲國家食品藥品監督管理局批準上市[1-2]。研究結果[3-7]表明，該藥通過抑制COX-2mRNA的表達而發揮其抗炎作用，對于急性和慢性炎癥具有潛在的治療作用，同時具有較高的安全性。艾瑞昔布為新化合物，化學名稱為1-正丙基-3-(4-甲基苯基)-4-(4-甲磺酰基苯基)-2,5-二氫-1H-2-吡咯酮。已有文獻[8-9]報道使用高效液相色譜-串聯質譜(liquidchromatography-masssepectrometry，LC-MS/MS)法測定生物樣品中艾瑞昔布及其代謝物的含量，制劑含量測定及質量控制方法則未見報道。本實驗首次建立了靈敏、簡便、快速的液相色譜-串聯質譜法[10]用于該制劑的分析檢測和質量控制。

1 儀器與試藥

API4000+型液相色譜-三重四級桿質譜聯用儀，配有電噴霧離子化源和Analyst1.6.1數據處理系統(ABSCIEX公司)；ProminenceCBM-20A型液相色譜儀，配有二元梯度泵、在線脫氣機、自動進樣和柱溫箱(日本島津公司)；CPA225D型電子天平(北京賽多利斯儀器系統有限公司)；KQ-300B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

艾瑞昔布對照品(江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，批號66311003，純度為99.6%)；奧美拉唑(魯南制藥有限公司，純度為99.7%)；艾瑞昔布片(江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，規格0.1g；批號，11102551、12070351、12100351)；乙腈為色譜純，水為純凈水。

2 方法與結果

2.1 試驗條件

2.1.1LC條件：色譜柱，WatersSymmetryRC18
(100mm×2.1mm，3.5μm)；柱溫，40℃;流動相，乙腈(A)-水(B)，梯度洗脫(0min，30%A；0～3min，30%→95%A；3～4min，95%A；4min，30%A；4～7min，30%A)；流速0.4mL/min；進樣量2μL。

2.1.2MS條件：離子源，電噴霧離子化源(ESI源)；監測方式，正離子監測；離子源噴射電壓5 500V；離子源溫度550 ℃；氣簾氣壓力10psi；碰撞氣壓力4psi；掃描方式，多反應監測；用于定量分析的離子反應分別為m/z370.2～278.2 (艾瑞昔布)和m/z346.1～198.0(奧美拉唑)，掃描時間100ms。

2.2 溶液的制備與測定方法

2.2.1 供試品溶液的制備：取艾瑞昔布片20片，精密稱定，研細，精密稱取適量(0.5g)，置于250mL量瓶中，加水50mL，振搖，加甲醇適量，超聲提取15min，放冷至室溫，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過。精密量取續濾液0.25mL，置于250mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 對照品溶液的制備：取艾瑞昔布對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并稀釋，獲得濃度為305.6mg/L的對照品貯備液。取該貯備液適量，加甲醇進行系列稀釋，獲得濃度為1 019.67、509.34、254.67、127.33、63.67μg/L的一系列標準溶液。

2.2.3 空白溶液的制備：按處方比例稱取一定量的不含艾瑞昔布的空白輔料，按照“2.2.1”項下方法制備空白溶液。

2.2.4 測定法：精密量取上述空白溶液、系列標準溶液和供試品溶液各0.5mL，分別精密加入濃度為84.7μg/L的奧美拉唑溶液0.5mL，搖勻。取2μL進樣測定，記錄艾瑞昔布和奧美拉唑的色譜峰峰面積。

2.3 結果

2.3.1MS條件的選擇：取200μg/L的艾瑞昔布標準溶液，以10μL/min的速度注入MS/MS儀，分別在正負離子檢測模式下記錄艾瑞昔布的一級MS和二級MS圖。結果表明，艾瑞昔布具有較強的正離子信號，正離子比較穩定，因此選擇正離子模式進行艾瑞昔布的定量檢測。分別選定艾瑞昔布和奧美拉唑的監測離子對為m/z370.2～278.2和m/z346.1～198.0。隨后進行系統優化，確定了MS檢測的最佳參數，包括源噴射電壓(5 500V)、源溫度(550℃)、氣簾氣壓力(10psi)、碰攔氣壓力(4psi)、CE(艾瑞昔布31eV，奧美拉唑14eV)、DP(艾瑞昔布120V，奧美拉唑52V)。

2.3.2 干擾試驗：取空白溶液、艾瑞昔布標準溶液和供試品溶液各適量，按照“2.2.4”項下方法采用LC-MS/MS法進行分析，記錄色譜圖。艾瑞昔布和奧美拉唑的保留時間分別為3.92min和2.63min，空白溶液中未見干擾峰，表明共存組分不會影響艾瑞昔布的定量檢測。

2.3.3 線性關系考察：取艾瑞昔布系列標準溶液適量，按“2.2.4”項下方法測定，記錄色譜圖。以艾瑞昔布的檢測濃度(X)為橫坐標，艾瑞昔布和奧美拉唑的峰面積比值(Y)為縱坐標，用加權最小二乘法進行回歸分析，計算得回歸方程為Y=0.002 65X+0.040 8(r=0.997 6，n=5)。結果表明，艾瑞昔布的檢測濃度在31.83～509.34mg/L范圍內線性關系良好。

2.3.4 檢測限(limitofdetection,LOD)和定量限(limitofquantity,LOQ)：取艾瑞昔布對照品溶液稀釋若干倍，按照“2.2.4”項下方法進樣分析，根據S/N≥3∶1，測得艾瑞昔布的LOD為0.5mg/L；根據S/N≥10∶1，測得艾瑞昔布的LOQ為1.5mg/L。

2.3.5 精密度試驗：取濃度為254.67mg/L的對照品貯備液，按照“2.2.4”項下方法進樣分析，重復進樣6次。結果，RSD=1.4%(n=6)，表明方法精密度良好。

2.3.6 重復性試驗：取適量樣品6份，分別按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，照上述色譜條件進樣測定。結果，RSD=1.2%(n=6)，表明方法重復性良好。

2.3.7 穩定性試驗：取同一份供試品溶液適量，分別于0、2、4、6、8、12h依法進樣測定。結果，RSD=1.1%(n=6)，表明艾瑞昔布在12h內穩定。

2.3.8 加樣回收率試驗：取同批樣品細粉適量(相當于艾瑞昔布50mg)，共9份，分別置于50mL量瓶中，加入艾瑞昔布對照品適量，配制成低、中、高三個濃度，按照“2.2.3”項下方法操作，測定含量，計算加樣回收率，見表1。

表1 回收率試驗結果Table 1 Results of recovery tests (n=9)

RSD：relative standard deviation

2.3.9 樣品含量測定：取3個批次的艾瑞昔布片，按照“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按照“2.2.4”項下色譜條件進行含量測定。3批樣品的含量測定結果見表2。

表2 樣品含量測定結果Table 2 Results of content determination of samples (n=3)

RSD：relative standard deviation

3 討 論

3.1 流動相的選擇：本實驗考察了流動相條件，甲醇-水、乙腈-水。發現流動相為甲醇-水時，峰型不好，形成多重峰。無論是改變流動相比例，還是使用等度、梯度洗脫，狀況均未改善。流動相改為乙腈-水時，峰型有了較好的改觀。本實驗又進一步考察了不同組成和不同梯度的流動相對分析結果的影響，使得艾瑞昔布與內標奧美拉唑的保留時間適中。結果表明艾瑞昔布與奧美拉唑可獲得良好地分離，未發現干擾成分，并且最終運行時間為7min，方法簡便、快速、準確。

3.2 內標的穩定性:奧美拉唑的結構具有亞磺酰基，是弱堿性化合物，在酸性溶液中容易降解，很快分解為砜化物和硫醚化物；同時，奧美拉唑溶液的穩定性受溫度和光線的影響，應低溫、避光、現配現用。

本實驗通過優化色譜和質譜條件建立了LC-MS/MS法測定艾瑞昔布片中艾瑞昔布的含量，經過方法學確證，結果表明本法專屬性好、靈敏度高、線性關系良好，適用于艾瑞昔布片劑的質量控制。

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CONTENTDETERMINATIONOFIMRECOXIBINIMRECOXIBTABLETSBYLC-MS/MS

LIFeigao1,LIUXizhe2,LUYanfang1,ZHAOXiaojuan1,ZHANGZhiqing1*

(1.DepartmentofPharmacy,theSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China;2.DepartmentofPharmacy,theThirdHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050051,China)

ObjectiveToestablishahighperformanceliquidchromatography-masssepectrometry(LC-MS/MS)methodforthedeterminationofimrecoxibinimrecoxibtablets.MethodsThesampleswerefirstlyextractedwithmethanol-watersolution(80∶20,V/V),andthenfilteredthrough0.22μmmicroporefilm.ThecontentofimrecoxibwasdeterminedbyLC-MS/MS.ThedeterminationwasperformedonWatersSymmetryRC18(3.5μm,2.1mm×100mm)columnwithgradientelution.Themassspectrometerwasoperatedinthepositiveionizationelectrospray(ESI)modeusingmultiplereactionmonitoringforanalysisofimrecoxibat550℃.Thetransitionsofm/z370.2-278.2(imrecoxib)andm/z346.1-198.0 (omeprazole)wereusedtoquantifyimrecoxibandomeprazole.ResultsThelinearrangeofimrecoxibwas31.83-509.34μg/L(r=0.997 6)andthemethodrecoverywaswithin95.6%-103.4% (RSD<6.1%,n=9).ConclusionThemethodisrapid,sensitiveandaccurate,anditissuitableforthequalitycontrolofimrecoxibtablets.

chromatography,highpressureliquid;tandemmassspectometry;imrecoxib

2013-05-20；

2013-08-28

李飛高(1985-)，男，河北邢臺人，河北醫科大學第二醫院藥師，理學碩士，從事臨床藥學、藥物新制劑研究。

*通訊作者。E-mail：777yyy@sina.cn

R446.1

A

1007-3205(2014)03-0249-03

劉斯靜)