銀杏葉提取物對大鼠視神經損傷后Bcl-2和Bax表達的影響

章 靜，吳香麗，劉麗霞，趙慧英，劉 彥

(1.河北省玉田縣醫院眼科，河北 玉田 064100； 2.北京老年醫院眼科，北京100095)

·論著·

銀杏葉提取物對大鼠視神經損傷后Bcl-2和Bax表達的影響

章 靜1，吳香麗2，劉麗霞1，趙慧英2，劉 彥2

(1.河北省玉田縣醫院眼科，河北 玉田 064100； 2.北京老年醫院眼科，北京100095)

目的觀察銀杏葉提取物(ginkgo biloba extract，EGb761)對大鼠視神經損傷的再生作用。方法設立3個組，正常組不做任何處理，對照組和治療組采用視神經夾傷方法，制作視神經不完全損傷模型。傷后1h，對照組給予0.05mL生理鹽水球后注射，治療組給予EGb761 0.05mL(100mg/kg)球后注射，均隔日1次，直至處死；采用HE染色觀察各組視網膜及視神經組織形態學變化，免疫組織化學法測定各組視神經中B淋巴細胞瘤2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、Bcl-2基因相關的X蛋白(BCL2-Associated X Protein，Bax)陽性細胞的多少以及Bcl-2/Bax的變化，以此推斷EGb761對受損視神經的再生作用。結果視神經組織中Bcl-2陽性細胞在實驗的第3、7、14、28天治療組較正常組與對照組顯著升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。視神經組織的Bax陽性細胞在實驗的第3、7天，治療組較正常組顯著升高(P<0.05)，較對照組顯著降低(P<0.05)，第14、28天治療組較正常組及對照組無明顯變化(P>0.05)。治療組Bcl-2/Bax比值在第3、7、14天時一直處于較高水平，第28天時開始降低，但仍較對照組高。結論EGb761能減輕外傷性視神經損傷后視神經損害，降低視神經組織Bax蛋白表達，增加Bcl-2蛋白表達，提高Bcl-2/Bax比值。EGb761對外傷性視神經損傷有一定的促再生及修復作用。

視神經損傷；銀杏；大鼠

10.3969/j.issn.1007-3205.2014.03.031

視神經損傷可導致嚴重的視力障礙，因此尋找有效的藥物阻止或延緩視神經損傷病變的發展，減輕或延遲視神經損害，是視神經損傷研究的一個主要方面。銀杏葉提取物(ginkgo biloba extract，EGb761)主要有效成分為銀杏黃酮和銀杏內酯，其在心血管疾病[1-2]、抗癌及神經系統退行性疾病[3]等方面的應用已有不少報道。本實驗制作大鼠視神經不完全損傷模型，采用球后注射的給藥方式，通過檢測凋亡相關基因B淋巴細胞瘤2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)和Bcl-2基因相關的X蛋白(BCL2-Associated X Protein，Bax)在大鼠視神經夾損傷后的表達，觀察EGb761促視神經再生的作用，旨在為EGb761治療視神經損傷的臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料：EGb761購自博奧森生物公司；一抗(均為兔抗IgG多克隆抗體)購自Santa Cruze 公司；SP9001試劑盒及DAB顯色劑購自北京中山生物技術有限公司；健康雌性8周SD大鼠60只(由河北省實驗動物中心提供)，體質量(250±10)g，實驗前10%水合氯醛(35mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，外眼及眼底檢查均無病變者納入實驗。Nikon尼康光鏡顯微照相機購自日本株式會社尼康公司；LEICA RM2125石蠟切片機購自萊卡上海分公司 ；醫學圖象分析系統購自廈門麥克奧迪儀器儀表有限公司。

1.2 方法：60只SD大鼠隨機分3組，每組20只，20眼，正常組不做任何處理。對照組和治療組制作大鼠視神經損傷模型，10%水合氯醛(35mg/kg)腹腔注射麻醉動物，碘伏消毒眼周圍皮膚，輕柔操作，沿角膜緣處剪開顳側球結膜，剪斷外直肌，彎剪鈍性分離暴露視神經，仔細分離視神經周圍血管，不能損傷血管，在球后2mm處用壓力恒定78g反向鑷(尖端1mm寬)夾閉視神經10s，直接眼底鏡觀察眼底，無視網膜出血，有動脈血液供應者納入實驗，夾閉球結膜，涂紅霉素眼膏。對照組于傷后1h右眼給予0.05mL生理鹽水球后注射，進針1cm，隔日1次，直至處死；治療組傷后1h右眼給EGb761(生理鹽水配制)0.05mL(100mg/kg)球后注射，具體操作和時間均同對照組，各組左眼均不做處理。

在3、7、14、28d每組隨機選取2只，10%水合氯醛(35mg/kg)腹腔注射麻醉動物，碘伏消毒右眼周圍皮膚，麻醉后以無菌處理的眼科剪及平鑷沿角膜緣剪開球結膜，鈍性分離暴露視神經，玻璃體內注射4%多聚甲醛0.01mL，防止視網膜皺縮，投入4%多聚甲醛固定液，用于免疫組織化學指標的測定。

各組大鼠視網膜及視神經組織進行HE染色，觀察視網膜及視神經形態學改變；視神經組織免疫組織化學測定Bcl-2和Bax的改變及Bcl-2/Bax的比值。

2 結 果

2.1 視神經組織Bcl-2的表達：Bcl-2表達陽性的細胞主要在胞質著色，胞核也可見到，呈彌漫或散在棕黃顆粒。正常組視神經中Bcl-2陽性細胞表達較弱，呈弱陽性表達。在3、7、14和28d本無明顯變化。對照組Bcl-2陽性細胞3d升高，7d開始下降，14d降至正常水平以下，28d時繼續維持在正常水平以下。治療組Bcl-2陽性細胞3d增高，7d時繼續增高，14d時雖稍有下降仍處于較高水平，28d時下降較明顯。

3、7d對照組Bcl-2陽性細胞平均光密度值較正常組顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)； 14d及28d對照組Bcl-2陽性細胞平均光密度值較正常組顯著降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。3、7、14及28d治療組Bcl-2陽性細胞平均光密度值較正常組顯著升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。3、7、14、28d治療組Bcl-2陽性細胞平均光密度值較對照組升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 3組不同時間點 Bcl-2陽性細胞平均光密度值變化 值)

*P<0.05與正常組比較 #P<0.05與對照組比較(重復測量設計資料的方差分析)

Bcl-2:B-cell lymphoma-2

2.2 視神經組織Bax的表達：Bax表達陽性的細胞主要在胞質著色，胞核也可見到，呈彌漫或散在棕黃顆粒。正常組Bax陽性細胞在3、7、14、28d基本無明顯變化。對照組Bax陽性細胞3d時升高，7d時仍處在較高水平，14d時下降至正常水平，28d時繼續維持在正常水平。治療組Bax陽性細胞3d時增高，7d時已開始下降，14d時將至正常水平，28d時繼續維持在正常水平。

3、7d對照組Bax陽性細胞平均光密度較正常組顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)，14、28d對照組與正常組比較差異無統計學意義(P>0.05)。3、7d治療組Bax陽性細胞平均光密度較正常組顯著升高,差別有統計學意義(P<0.05)；14、28d治療組與正常組比較差異無統計學意義(P>0.05)。3、7d治療組Bax陽性細胞平均光密度較對照組顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)；14、28d治療組與對照組差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 3組不同時間點Bax陽性細胞平均光密度值變化 值)

*P<0.05與正常組比較 #P<0.05 與對照組比較(重復測量設計資料的方差分析)
Bax：BCL2-Associated X Protein

2.3 視神經組織中Bcl-2/Bax比值比較：視神經組織Bcl-2/Bax比值在3、7、14、28d 4個時間點,正常組分別為1.117、1.115、1.119、1.115，對照組分別為1.123、1.016、1.032、1.017，治療組分別為1.679、1.881、1.831、1.367。治療組 Bcl-2/Bax比值3、7、14d時一直處于較高水平，28d時開始降低，但仍較正常組比值高。

3 討 論

視神經是具有中樞神經特征的周圍神經，由視神經節細胞(retinal ganglion cells,RGCs)胞體發出的軸索和視神經膠質細胞組成，不含神經元胞體和室管膜細胞，成分單一。RGCs為終端分化的神經細胞，其軸突組成視神經的纖維部。所謂再生或視神經的修復再生即是指RGCs軸突的再生而不是指胞體。研究[4]表明視神經鉗夾傷后，視網膜神經元存在凋亡，是導致視網膜神經節細胞及內核層、外核層神經元死亡的重要方式。既往研究[5]認為視神經損傷以后再生困難，近年來隨著研究的增多和深入，證明在特定的環境下視神經是可以再生的，但目前尚沒有明確的治療方法。EGb761具有多種多樣的生物學效應，它的主要藥理作用有：①對細胞代謝及某些酶的作用；②對激素和受體的作用；③對線粒體的保護作用；④清除自由基。許多研究[6-8]表明EGb761可以改善腦和中樞神經系統的血液供應，保護神經細胞免受損傷，改善神經退行性病變和衰老引起的認知能力的下降及提高記憶力，在阿爾茨海默病神經系統凋亡方面的治療已得到肯定。在心血管方面具有減少血管痙攣、保護血管內皮細胞損傷、降低血液黏稠度、抗氧化活性、抑制血小板激活因子的活性、清除自由基、抗炎、抗變態反應等藥理作用。研究[9]表明EGb761注射液可增加健康絕經后女性冠狀動脈血流。細胞凋亡是細胞在基因指導下的主動死亡形式，基因調控在細胞凋亡過程中起重要作用。凋亡相關基因可分為凋亡促進基因和凋亡抑制基因2種。這兩類基因相互作用的結果決定細胞是生存還是凋亡。目前認為Bcl-2的高表達能阻抑多種凋亡誘導因素所引發的細胞凋亡[10]。本實驗中應用EGb761的治療組在實驗各階段Bcl-2蛋白表達均較正常組及對照組顯著增多，說明EGb761能促使Bcl-2蛋白表達增多，且能使其較長時間維持在較高水平，從而間接抑制細胞凋亡。而Bcl-2家族成員之一Bax具有促進細胞凋亡的作用，是典型的凋亡促進基因。本實驗中Bax陽性細胞平均光密度在實驗第3、7天時均較正常組及對照組顯著降低，說明EGb761有抑制Bax細胞增多的作用，有些學者認為Bcl-2與Bax 2種蛋白的比例是決定細胞是否凋亡的關鍵[11]。本實驗中治療組 Bcl-2/Bax比值第3、7、14天時一直處于較高水平，第28天時開始降低，但仍較正常組高，說明EGb761能夠增加Bcl-2/Bax比率。由此我們推斷EGb761通過增加Bcl-2蛋白的表達和減弱Bax蛋白的表達來抑制視神經損傷后RGCs細胞凋亡，從而起到減低視神經損傷，促進其修復的作用。實驗中單獨設立正常組而不用實驗鼠左眼作為正常組目的是為避免實驗大鼠因右眼受傷后引起對側眼凋亡基因表達異常的影響因素。

本研究結果表明EGb761對視神經的再生與修復有一定的治療作用，其促再生作用是通過抑制凋亡實現的。由于EGb761有多種多樣的生物學效應，也有實驗研究[12]發現EGb761能抑制大鼠顱內C6膠質瘤細胞生長，作用機制可能與抑制膠質瘤細胞增殖及誘導腫瘤細胞凋亡有關。可能對凋亡的調節有雙向作用，也可能在促視神經損傷修復作用中有多種多樣的機制共存，這有待進一步探討。

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2013-02-25；

2013-06-17

唐山市科學技術研究與發展計劃項目(13130290b)

章靜(1979-)，女，河北玉田人，河北省玉田縣醫院主治醫師，醫學學士，從事眼科疾病診治研究。

R774.6

B

1007-3205(2014)03-0336-03

劉斯靜)