大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌β-內酰胺酶的篩選

孫文洪 陳炳豪 朱麗梨 黃國賢 謝映紅 黃雪瓊

隨著第3代頭孢菌素如頭孢曲松、頭孢噻肟、頭孢他啶和單環酰胺類抗菌藥物在臨床上的廣泛應用，耐藥的革蘭陰性菌不斷增加，造成治療上的困難。目前導致院內感染的主要菌屬仍為革蘭陰性菌。革蘭陰性桿菌對β-內酰胺類抗生素的主要耐藥機制是產生β-內酰胺酶，其中以超廣譜β-內酰胺酶（ESBLs）為主，它位于質粒上，可由質粒在相同或不同菌種間水平傳播；而AmpCβ-內酰胺酶主要是染色體介導的，但近年來質粒介導的AmpC酶也陸續在世界各地發現，且多見于大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌。為調查廣州番禺區中心醫院兩種酶的產出情況，本研究在367株大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌中篩選β-內酰胺酶。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 367株無重復大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌從本院2013年1月～2013年6月的各種臨床標本中分離得到，其中大腸埃希菌156株，肺炎克雷伯菌211株。質控菌株為大腸埃希菌ATCC25922和肺炎克雷伯菌ATCC700603。

1.1.2 MH培養基 Oxiod產品。

1.1.3 藥敏紙片 頭孢泊肟（Cefpodoxime，CPD）、頭孢他啶(Ceftazidime，CAZ)、頭孢曲松（Ceftriaxone Sodium，CRO）、頭孢噻肟(Cefotaxime Sodium，CTX)、頭孢西丁(Cefoxitin，FOX)、頭孢他啶/克拉維酸（CAZ/ Clavulanic acid，CLA）、頭孢噻肟/克拉維酸（CTX/CLA）、頭孢哌酮/舒巴坦（Sulbactam，SCF）、亞胺培南（Imipenem，IPM）、復方磺胺甲基異惡唑(Sulfamethoxazole，SMZ)、環丙沙星(Ciprofloxacin，CIP)、阿米卡星(Amikacin，AMK)均為Oxoid產品。

1.1.4 微生物鑒定系統 采用Compact60系統（BioMé rieux，法國）進行鑒定。

1.2 方法

1.2.1 初篩試驗 根據藥敏紙片結果，將頭孢泊肟或頭孢他啶抑菌環直徑≤22mm、頭孢曲松抑菌環直徑≤25mm、頭孢噻肟抑菌環直徑≤27mm，FOX≤17mm的菌株判定為疑產ESBLs菌株。若FOX>17mm的菌株疑為AmpC+。

1.2.2 ESBL表型確診試驗[1]在MH瓊脂平皿上，按NCCLS標準方法接種待測菌，并貼上頭孢他啶(CAZ)、頭孢他啶/克拉維酸和頭孢噻肟(CTX)、頭孢噻肟/克拉維酸兩對紙片，經35℃溫育16～18h，觀察結果，兩對紙片中的任何一對的抑菌圈如相差5mm以上確認為ESBL。同時以肺炎克雷伯菌ATCC700603株作為陽性對照。

1.2.3 頭孢西丁三相試驗 采用Coudron反復凍融法[4]并作部分改動。挑取過夜培養的受試菌落數個，加入30mL胰蛋白胨培養基中，37℃180r/min振搖12～16h。－80℃及37℃反復凍融菌液5次，加入0.1mol/L pH7.0的磷酸鹽緩沖液1mL，振蕩混勻，離心提取酶粗制品。在MH瓊脂平皿上按NCCLS標準方法接種大腸埃希菌ATCC25922，在平皿中央貼一FOX紙片，用無菌刀片在瓊脂表面離FOX紙片邊緣5mm處放射狀切一裂縫，在裂縫里加入25μL粗提物，35℃孵育16～18h后，觀察抑菌圈的形狀，如裂縫與抑菌圈交接處出現細菌擴大生長， 而含氯唑西林的切槽無變化，說明裂縫里的粗提物使頭孢西丁失活，氯唑西林抑制AmpC酶活性，為AmpC酶陽性。

2 結果

2.1 β-內酰胺酶檢出率 全部實驗菌株367株，115株產ESBLs，總陽性率為31.3%，其中大腸埃希菌156株，陽性43株（27.6%）；肺炎克雷伯菌 211株，陽性 72株（34.1%）。17株產AmpC酶，總陽性率為4.6%，其中大腸埃希菌陽性7株（4.5%）；肺炎克雷伯菌陽性10株（4.7%）。

2.2 藥物敏感性檢測 所檢測的菌株對亞胺培南全部敏感，產酶株對阿米卡星、環丙沙星敏感性由40%～60%不等；產ESBLs菌株對頭孢西丁也較敏感，在三代頭孢菌素中，對頭孢哌酮/舒巴坦的敏感性較好；產AmpC酶菌株對頭孢西丁及三代頭孢菌素的耐藥性明顯（見表1）。

3 討論

ESBLs主要由腸桿菌科細菌產生，肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌為其代表菌種。自1983年歐洲首次發現ESBLs以來，世界各地均有產ESBLs菌感染。新型超廣譜β-內酰胺類抗生素廣泛應用所產生的選擇壓力是導致ESBLs產酶菌發生的主要原因[1-2]，因此臨床上應該嚴格限制該類藥物作為常規經驗治療，以減輕抗生素的選擇壓力，防治產ESBLs菌株的產生和流行，可以選用如β-內酰胺酶抑制劑復合制劑、頭霉素類、碳青霉烯類等作為替代品，可有效地減少了ESBLs產酶菌的臨床分離率[3]。阿米卡星系氨基糖甙類抗生素，也可用于治療產ESBLs菌引起的感染，但對產ESBLs菌的耐藥率也較高，一般認為是編碼產生ESBLs的質粒常攜帶著對這些抗生素耐藥的基因。因此，在選擇阿米卡星治療產ESBLs菌引起的感染時，應根據藥敏結果進行[4]。另外，由于不產ESBLs株對各種抗生素的敏感性均高于產ESBLs株，因此相應實驗室應該進行ESBLs的常規檢測并及時報告，這對于指導臨床合理選擇抗菌藥物，提高療效具有顯著意義。

表1 367株大腸埃希菌和肺炎克雷白桿菌藥敏結果

ESBLs產酶菌為15%，其中又多見于腸桿菌科細菌。在腸桿菌科細菌中以肺炎克雷伯菌最為常見，產ESBLs肺炎克雷伯菌占產ESBLs腸桿菌科細菌的16.9%～75.0%，其次產ESBLs的細菌是大腸埃希菌[5-8]。各個國家和地區產ESBLs菌株的發生率明顯不同，這與該地區抗生素使用水平和細菌培養耐藥性監測相關，日本、荷蘭等國家產ESBLs菌株的發生率很低，而法國、印度等國家產ESBLs菌株的發生率很高，可有高達50%以上的克雷伯菌屬的菌株產生ESBLs，而且具有較嚴重的耐藥性[9]。本院大腸埃希菌中產ESBLs菌株的發生率27.6%，肺炎克雷伯菌中為34.1%，處于較低水平，這與本單位對抗菌藥物管理及耐藥性監測工作的開展相關。

AmpC酶是另一大類β-內酰胺酶，它主要由腸桿菌屬、弗勞地枸櫞酸菌、摩根摩根菌、黏質沙雷菌、銅綠假單胞菌產生的染色體介導的AmpC酶，以及近年來發現的質粒介導的AmpC酶，它主要位于大腸埃希菌、克雷白桿菌屬、腸桿菌屬細菌中。編碼AmpC酶的質粒與編碼ESBLs的質粒一樣，可同時攜帶氨基糖甙類、四環素類和磺胺類等的抗藥性基因。本研究的17株陽性株，除了對頭霉素和三代頭孢菌素耐藥外，對氨基糖甙類和磺胺類也有不同程度的耐藥。另外AmpC酶的特點之一是不能被β-內酰胺酶抑制劑如克拉維酸抑制。因此在治療可疑產AmpC酶細菌的感染時，更應考慮選擇合適的抗生素，碳青霉烯類抗生素和第四代頭孢菌素如頭孢吡肟可以作為產AmpC酶細菌有效的抗生素[1-2]。

于產AmpC的菌株的檢測，NCCLS尚未出臺標準[10]，臨床實驗室通常只能根據耐藥表型（如對第二、三代頭孢菌素耐藥，而雙紙片協同試驗陰性，對第四代頭孢菌素敏感等）綜合判斷推測。藥敏試驗中需包含頭霉素類和含酶抑制劑的復合制劑是許多學者的共識。在大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌中，由于C類酶水解頭孢西丁，Coudron等提出采用酶提取物三維試驗法檢測AmpC酶，但此法常規操作較為困難，因此有必要研究適合常規實驗室的、操作快速簡便的檢測AmpC酶的方法。

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