在線柱切換反相高效液相色譜法測定大鼠血漿丁螺環酮濃度及藥代動力學研究

張曉惠，王 榮，謝 華，尹 強，李曉云，賈正平，張娟紅，李文斌

丁螺環酮是一種非苯二氮艸卓類抗焦慮藥物，能夠治療高原環境下產生的焦慮、煩躁等癥狀，具有療效好，不良反應少，無耐受性和依賴性等優點，缺點是首關效應明顯，生物利用度低，因此，對其藥代動力學的研究有助于指導臨床合理用藥［1］，也為高原環境中應用鹽酸丁螺環酮提供一定的藥代動力學依據。目前對血樣中丁螺環酮的檢測方法主要有氣相色譜－質譜法、液相色譜－質譜法、高效液相色譜法，但血樣的前處理方法均為離線處理，存在操作繁瑣、成本高、選擇性低等缺點［2-6］。柱切換技術可實現樣品的在線預處理，能克服傳統離線處理方法的缺點。本實驗利用實驗室自制的限進性填料柱對大鼠血漿樣品進行在線預處理，使丁螺環酮在預處理柱上保留并除去蛋白等大分子雜質，實現血樣的直接進樣分析，具有簡便、快速、靈敏、準確等優點，適合生物樣品中丁螺環酮的藥代動力學研究。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 柱切換－反相高效液相色譜系統:2個LC-6A泵、SPD-6AV紫外檢測器、CTO-6A柱溫箱(日本島津公司);7725i進樣閥(美國Rheodyne公司);7000型切換閥(美國Rheodyne公司);色譜信號由SCL-6A控制器(日本島津公司)控制;超聲波清洗器(天津奧特賽恩思儀器有限公司);TGL-16B型離心機(上海安亭科學儀器廠);AE-240型電子天平(上海梅特勒－托利多)。

1.2 試藥 甲醇為分析純試劑(四川西隴化工有限公司，批號:120319)，水為滅菌注射用水(西安雙鶴制藥有限公司，批號:110128112)，丁螺環酮對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號:101059-201101)，丁螺環酮片(北大國際醫院集團西南合成制藥股份有限公司，批號:H19990302)。

2 實驗方法

2.1 色譜條件 預處理柱為內表面反相限進性填料柱(45.0 mm ×4．6 mm，5.0 μm;實驗室自制)，預處理流動相:水 －甲醇(95∶5，V/V)，流速:1 ml/min。分析柱為(Luna C18，250.0mm ×4．6 mm，5.0 μm;美國 phenomenex 公司)，分析流動相:甲醇－5 mmol/L甲酸銨(75∶25，V/V)，流速:1 ml/min。進樣量:20 μl;柱溫:25℃;檢測波長:283 nm。

2.2 溶液的制備

2.2.1 標準溶液:精密稱量0．01 g鹽酸丁螺環酮對照品于10 ml的量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，配成1 mg/ml的丁螺環酮儲備液，置 4℃下保存。

2.2.2 內標溶液:精密稱取0．001 g非洛地平標準品于10 ml的量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，配成0．1 mg/ml的非洛地平標準溶液。

2.3 血漿樣品預處理 取SPF級雄性Wistar大鼠(由中國上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，動物合格證號:200700524909)血漿樣品1 ml，置于2 ml具塞離心試管中，于5000 r/min速率下離心5 min，精密吸取上清液置于另一離心試管中，在－20℃下冷凍保存。測定樣品時，在室溫下融解，吸取 0．1 ml上清液，加 5 μl 0．1 mg/ml的非洛地平標準溶液。直接進樣20 μl。

2.4 實驗過程 進樣時，切換閥如圖1A連接，預處理柱與分析柱呈并聯狀態，因此，進樣后，樣品先進入預處理柱，待3 min后，血漿中的大分子蛋白等雜質隨預處理流動相沖出，而丁螺環酮及其他小分子物質被保留在預處理柱上，此時，進行切換，使切換閥如圖1B連接，預處理柱與分析柱呈串聯狀態，分析流動相將保留在預處理柱上的丁螺環酮及其他小分子物質洗脫至分析柱進行分離分析。分析完畢后，將閥切換至初始狀態，使預處理流動相和分析流動相分別平衡預處理柱和分析柱5 min，以便下次進樣。

3 結果

3.1 方法專屬性 在上述柱切換－反相高效液相色譜條件下對空白血漿、空白血漿加對照品及大鼠血漿樣品的色譜圖進行比較，丁螺環酮的出峰時間為 9．6 min，內標出峰時間為 13．0 min，波長為283 nm時，丁螺環酮與內標峰完全分離，互不干擾，峰形良好，見圖2。

3.2 標準曲線的繪制 取空白血漿，加丁螺環酮儲備液及內標儲備液，配成丁螺環酮質量濃度分別為0．2、0．3、0．6、1．2、2．4、4．8 μg/ml的系列血漿標準樣品，按“2．3”項下方法處理后，精密吸取 20 μl進樣，在優化的色譜條件下進行分離，測定峰面積。以峰面積與內標峰面積的比值(As/Ai)為縱坐標(Y)，以丁螺環酮的質量濃度(μg/ml)為橫坐標(X)，繪制標準曲線，得線性回歸方程為Y=0．2219 X+0．0004(r=0．9993)，結果表明:血漿中的丁螺環酮在0．2～4．8 μg/ml的濃度范圍內有良好的線性關系。

圖1 柱切換－反相高效液相色譜系統示意圖

圖2 空白血漿、空白血漿加對照品及大鼠血漿樣品高效液相色譜圖

3.3 精密度及回收率 按照“3．2”項下方法配制質量濃度分別為 0．3、0．6、2．4 μg/ml的丁螺環酮標準血漿樣品，按“2．3”項下方法處理后，采用柱切換－反相高效液相色譜法測定，1 d內測定6次，連續測定3 d，計算日內及日間的相對標準偏差(RSD)，RSD 為 0．07%～3．54%，說明本方法精密度較好?；厥章蕦嶒炛?，分別考查了3個加標水平0．3、0．6、2．4 μg/ml的丁螺環酮的血漿樣品，處理方法同上，每個水平連續測5次，計算平均回收率，結果顯示符合生物樣品測定方法的要求，見表1。

表1 3個濃度丁螺環酮的精密度和平均回收率

3.4 穩定性

3.4.1 常溫放置穩定性:配制質量濃度分別為0.3、0.6、2.4 μg/ml的丁螺環酮血漿標準樣品，按“2.3”項下方法處理后，于室溫下放置 0、2、4、8、12、24 h，結果3個濃度的血漿標準樣品RSD分別為2.00% 、1.05%、1.96% 。

3.4.2 反復凍融穩定性:配制質量濃度為0.6 μg/ml的丁螺環酮標準血漿樣品，按“2．3”項下方法處理后，在 －20℃下反復凍融72 h，RSD為1．87%。

3.5 樣品的測定 隨機選取Wistar大鼠6只，體重200～220 g，自由飲水，禁食12 h后，按15 mg/kg劑量給予丁螺環酮片劑灌胃，并于給藥后0．08、0．25、0．5、0．75、1、1．5、2、4、6、8、12、24 h 經大鼠眼球后靜脈叢采血0．5 ml，置于肝素化試管中，在5000 r/min的速率下離心5 min，取上清液于－40℃冷凍保存，采用本實驗建立的柱切換－反相高效液相色譜法測定大鼠體內丁螺環酮的血藥濃度并繪制平均血藥濃度－時間曲線(圖3)，采用藥物動力學處理軟件DAS 2．0程序對丁螺環酮的血藥濃度－時間曲線進行擬合，求算藥代動力學參數。其血藥濃度－時間曲線面積 AUC0→8為 3．023 μg/(ml·h)，AUC0→∞為4．056 μg/(ml·h)，半衰期(t1/2)為3．944 h，最大濃度 (Cmax)為 1．38(μg/ml)，清 除 率 (CLZ)為3．712 L/(h·kg)。

圖3 丁螺環酮在大鼠體內的平均血藥濃度－時間曲線

4 討論

柱切換技術是通過改變進樣閥與色譜柱、檢測器之間的連接關系，通過改變流動相的走向或流動相系統，達到樣品的凈化、富集和分離等目的。目前已有單柱單泵、單泵雙柱、雙柱雙泵及多柱多泵等模式，還可根據實驗需要自行設計［7-8］。本文采用雙泵雙柱模式，由2個泵、1個進樣閥、1個切換閥、限進性填料柱及分析柱組成。限進性填料是一種新的樣品前處理技術，其中的內表面反相限進性填料應用較多，該填料是在硅膠表面鍵合一層親水層，能夠限制蛋白質的吸附，內表面具有疏水性，小分子物質可進入內孔與內表面的疏水基團相互作用而被保留，而大分子物質則不能滲透進入，因此，在死體積或接近死體積時大分子物質被洗脫下來，而不會引起蛋白在色譜柱上沉淀或不可逆吸附而造成色譜柱柱壓升高及毀壞［9-13］。

限進性填料柱能夠通過柱切換技術實現生物樣品的在線除蛋白過程，其中切換時間是影響除蛋白的一個關鍵因素，切換時間過早，血漿中的蛋白還沒有被完全除去，會引起蛋白在色譜柱上沉淀或不可逆吸附而造成色譜柱柱壓升高或毀壞;切換過晚，會造成色譜峰展寬，分析時間延長，因此，切換時間的選擇以蛋白質完全被洗脫的時間為最佳。本實驗將預處理柱與檢測器連接，在波長為280 nm下進空白血漿，結果表明:3 min內血漿中的蛋白質基本能被完全洗脫，因此，選擇3 min為切換時間。

本文將限進性填料柱與柱切換技術相結合，建立了一種快速在線檢測大鼠血漿中丁螺環酮濃度的方法，該方法可實現樣品的直接進樣，有效縮短了分析時間，減少血漿樣品用量，降低血漿樣品離線處理過程中的誤差，具有較好的線性關系、精密度及回收率，操作簡便，特異性好，適合生物樣品中丁螺環酮的藥代動力學研究，為丁螺環酮的高原藥代動力學研究提供了一種新方法和依據。

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