龍膽堿對高熱驚厥大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響

劉學(xué)偉，汪 娜，姚素媛，劉樹民(通訊作者)

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱150040)

研究表明，反復(fù)或持續(xù)高熱驚厥(Febrile Convulsions，F(xiàn)C)常導(dǎo)致兒童智力低下等繼發(fā)性腦損傷[1］。課題組前期研究結(jié)果顯示，中藥龍膽經(jīng)堿化處理后獲得的活性成分龍膽堿具有一定的抗驚厥作用，且對驚厥性腦損傷具保護(hù)作用，其作用機(jī)制涉及多個方面[2－5］。而凋亡與驚厥性腦損傷關(guān)系密切，龍膽堿是否通過抑制凋亡而發(fā)揮其抗腦損傷作用少有報道，因此，本實(shí)驗(yàn)通過探討龍膽堿對驚厥后海馬神經(jīng)元的凋亡的抑制作用，進(jìn)而闡明龍膽堿的腦損傷保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑及儀器:龍膽堿(自制，經(jīng) mp、UV、IR、1H NMR、13C NMR、MS鑒定，純度經(jīng)HPLC峰面積歸一化法檢測，龍膽堿含量＞98.4%);原位細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(北京中杉金橋公司);研究用生物顯微鏡(Olympus Bx60日本);數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(MoticMed6.0福建)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物與分組:21日齡Wistar大鼠100只，雌雄各半，體重50±20 g，[上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司，許可證號為:SCXK(滬)，2003－003］。按照有關(guān)文獻(xiàn)方法[2，6］。100只大鼠隨機(jī)抽取15只作為對照組，其余85只進(jìn)行篩選，首次驚厥，大鼠在水中5 min如不驚厥則取出棄去不用，5min內(nèi)發(fā)生驚厥者則驚厥開始時即取出，共有61只鼠進(jìn)入實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組再次隨機(jī)分為FC組、GT1、GT2組。GT1、GT2組于每次驚厥后立即注射200mg/kg、50mg/kg(2013RFQXJ154)龍膽堿生理鹽水溶液。FC組及空白對照組給予同體積生理鹽水。隔日誘導(dǎo)驚厥1次，共10次。空白組置37℃水浴中5min，共10 次。

1.3 標(biāo)本制備及檢測:大鼠末次驚厥后24 h，以20%烏拉坦腹腔注射麻醉，剖胸暴露心臟，經(jīng)左心室－升主動脈插管先用生理鹽水再用4%多聚甲醛經(jīng)左心室灌注，使腦標(biāo)本固定石蠟包埋標(biāo)本，冠狀切片，切片厚度10μm，按照原位末端脫氧核苷酸生物素末端標(biāo)記檢測試劑盒提供方法及操作步驟進(jìn)行。

1.4 結(jié)果判定和陽性細(xì)胞分析方法:TUNEL染色法觀察神經(jīng)細(xì)胞凋亡的表達(dá)，陽性細(xì)胞為細(xì)胞核著棕褐色。細(xì)胞凋亡切片圖像結(jié)果分析方法:采用MoticMed6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)，每組選7張切片，利用顯微攝像系統(tǒng)，每張切片在200倍下隨機(jī)選取海馬5個非重疊視野，按照512×512像素分布攝入圖像并保存于病理圖像分析系統(tǒng)內(nèi)，選擇凋亡分析模塊，通過灰度調(diào)節(jié)，區(qū)分視野內(nèi)凋亡細(xì)胞面積與平均灰度，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:應(yīng)用SPSS 14.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)值以)表示。各組間差異，用均值間兩兩比較，采用t檢驗(yàn)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

TUNEL染色后模型組海馬區(qū)可見較多神經(jīng)細(xì)胞核呈棕褐色陽性反應(yīng)，凋亡細(xì)胞面積顯著增加，平均灰度明顯增強(qiáng)，與正常組比較P＜0.01。而龍膽堿高、低劑量組細(xì)胞核棕褐色的陽性細(xì)胞面積較模型組明顯減少(P＜0.01)，平均灰度明顯降低，與FC組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。龍膽堿高、低劑量組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。正常對照大鼠僅偶見TUNEL陽性染色細(xì)胞核。

表1 TUNEL法檢測各組大鼠凋亡細(xì)胞面積與平均灰度

表1 TUNEL法檢測各組大鼠凋亡細(xì)胞面積與平均灰度

注:#與空白組比較P＜0.01，*與FC組比較P＜0.05

組別 例數(shù) 凋亡細(xì)胞面積 平均灰度NG組7 110.161 ±55.289 120.487 ±4.315 FC 組 7 1 741.202 ±403.904# 130.249 ±4.189#GT1 組 7 474.431 ±166.166* 119.591 ±4.153*GT2 組 7 399.950 ±190.548* 121.642 ±8.646*

3 討論

研究表明，驚厥發(fā)作可導(dǎo)致海馬、杏仁核、大腦皮質(zhì)、丘腦、小腦等多部位神經(jīng)元喪失，而這種神經(jīng)元喪失是通過壞死與凋亡兩條途徑實(shí)現(xiàn)的[7］。驚厥發(fā)生時會導(dǎo)致興奮毒性神經(jīng)元損傷的谷氨酸NMDA受體激活及細(xì)胞內(nèi)鈣超載均可啟動凋亡發(fā)生[8］，故認(rèn)為凋亡與驚厥性腦損傷關(guān)系密切。不僅如此，凋亡發(fā)生多少還可反映驚厥發(fā)作嚴(yán)重程度，反復(fù)多次或嚴(yán)重強(qiáng)直陣攣性抽搐可誘發(fā)大量細(xì)胞凋亡，因此推測凋亡不但是驚厥性腦損傷結(jié)果，更可能通過引起腦內(nèi)抑制性神經(jīng)元丟失，進(jìn)一步增加腦組織興奮性，從而導(dǎo)致更嚴(yán)重的驚厥性腦損傷，故凋亡減輕與否可能直接影響驚厥性腦損傷程度。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組中胞質(zhì)中膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡較多，由于正常情況下膠質(zhì)細(xì)胞對神經(jīng)細(xì)胞提供營養(yǎng)、支持與保護(hù)作用，提示驚厥后海成區(qū)神經(jīng)細(xì)胞失去營養(yǎng)供應(yīng)與保護(hù)，超微結(jié)構(gòu)發(fā)生紊亂，導(dǎo)致腦損傷的發(fā)生。通過TUNEL法觀察，模型組可見較多神經(jīng)細(xì)胞核呈棕褐色陽性反應(yīng)，凋亡細(xì)胞面積顯著增加，平均灰度明顯增強(qiáng)。而龍膽堿高、低劑量組細(xì)胞核棕褐色的陽性細(xì)胞面積較模型組明顯減少，平均灰度明顯降低，提示應(yīng)用藥物后可以抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生，該作用可能是龍膽堿發(fā)揮腦損傷保護(hù)作用的機(jī)制之一。

[1]周戩平，鄭娜，王帆，等.熱性驚厥對大鼠行為運(yùn)動及空間學(xué)習(xí)記憶的影響[J］.中華兒科雜志，2004，42(1):50.

[2]劉樹民，劉學(xué)偉，姚素媛，等龍膽堿對高熱驚厥模型大鼠所致海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用研究[J］.中醫(yī)藥學(xué)報，2009，37(6):11－13.

[3]姚素媛，劉學(xué)偉，劉樹民，等龍膽堿對高熱驚厥模型大鼠腦內(nèi)氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)含量及海馬區(qū)GABAB、Glu受體的影響[J］.時珍國醫(yī)國藥，2009，18(12):2875 －2877.

[4]Liu－XW，Liu－SM.Gentianine protects hippocampal neurons in a ratmodel of recurrent febrile convulsion.Neural Regeneration Reseatch.2011，6(15):1130 －1135.

[5]劉學(xué)偉，曹敏，劉樹民.龍膽堿的解熱作用及機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究，中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，(17)24:137－140.

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