龍膽堿對高熱驚厥大鼠海馬神經細胞凋亡的影響

劉學偉，汪 娜，姚素媛，劉樹民(通訊作者)

(黑龍江中醫藥大學，黑龍江哈爾濱150040)

研究表明，反復或持續高熱驚厥(Febrile Convulsions，FC)常導致兒童智力低下等繼發性腦損傷[1］。課題組前期研究結果顯示，中藥龍膽經堿化處理后獲得的活性成分龍膽堿具有一定的抗驚厥作用，且對驚厥性腦損傷具保護作用，其作用機制涉及多個方面[2－5］。而凋亡與驚厥性腦損傷關系密切，龍膽堿是否通過抑制凋亡而發揮其抗腦損傷作用少有報道，因此，本實驗通過探討龍膽堿對驚厥后海馬神經元的凋亡的抑制作用，進而闡明龍膽堿的腦損傷保護作用機制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑及儀器:龍膽堿(自制，經 mp、UV、IR、1H NMR、13C NMR、MS鑒定，純度經HPLC峰面積歸一化法檢測，龍膽堿含量＞98.4%);原位細胞凋亡檢測試劑盒(北京中杉金橋公司);研究用生物顯微鏡(Olympus Bx60日本);數碼醫學圖像分析系統(MoticMed6.0福建)等。

1.2 實驗動物與分組:21日齡Wistar大鼠100只，雌雄各半，體重50±20 g，[上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號為:SCXK(滬)，2003－003］。按照有關文獻方法[2，6］。100只大鼠隨機抽取15只作為對照組，其余85只進行篩選，首次驚厥，大鼠在水中5 min如不驚厥則取出棄去不用，5min內發生驚厥者則驚厥開始時即取出，共有61只鼠進入實驗組。實驗組再次隨機分為FC組、GT1、GT2組。GT1、GT2組于每次驚厥后立即注射200mg/kg、50mg/kg(2013RFQXJ154)龍膽堿生理鹽水溶液。FC組及空白對照組給予同體積生理鹽水。隔日誘導驚厥1次，共10次。空白組置37℃水浴中5min，共10 次。

1.3 標本制備及檢測:大鼠末次驚厥后24 h，以20%烏拉坦腹腔注射麻醉，剖胸暴露心臟，經左心室－升主動脈插管先用生理鹽水再用4%多聚甲醛經左心室灌注，使腦標本固定石蠟包埋標本，冠狀切片，切片厚度10μm，按照原位末端脫氧核苷酸生物素末端標記檢測試劑盒提供方法及操作步驟進行。

1.4 結果判定和陽性細胞分析方法:TUNEL染色法觀察神經細胞凋亡的表達，陽性細胞為細胞核著棕褐色。細胞凋亡切片圖像結果分析方法:采用MoticMed6.0數碼醫學圖像分析系統，每組選7張切片，利用顯微攝像系統，每張切片在200倍下隨機選取海馬5個非重疊視野，按照512×512像素分布攝入圖像并保存于病理圖像分析系統內，選擇凋亡分析模塊，通過灰度調節，區分視野內凋亡細胞面積與平均灰度，進行統計分析。

1.5 統計學處理:應用SPSS 14.0軟件進行統計分析，數值以)表示。各組間差異，用均值間兩兩比較，采用t檢驗。

2 實驗結果

TUNEL染色后模型組海馬區可見較多神經細胞核呈棕褐色陽性反應，凋亡細胞面積顯著增加，平均灰度明顯增強，與正常組比較P＜0.01。而龍膽堿高、低劑量組細胞核棕褐色的陽性細胞面積較模型組明顯減少(P＜0.01)，平均灰度明顯降低，與FC組比較差異有統計學意義(P＜0.05)。龍膽堿高、低劑量組之間差異無統計學意義(P＞0.05)。正常對照大鼠僅偶見TUNEL陽性染色細胞核。

表1 TUNEL法檢測各組大鼠凋亡細胞面積與平均灰度

表1 TUNEL法檢測各組大鼠凋亡細胞面積與平均灰度

注:#與空白組比較P＜0.01，*與FC組比較P＜0.05

組別 例數 凋亡細胞面積 平均灰度NG組7 110.161 ±55.289 120.487 ±4.315 FC 組 7 1 741.202 ±403.904# 130.249 ±4.189#GT1 組 7 474.431 ±166.166* 119.591 ±4.153*GT2 組 7 399.950 ±190.548* 121.642 ±8.646*

3 討論

研究表明，驚厥發作可導致海馬、杏仁核、大腦皮質、丘腦、小腦等多部位神經元喪失，而這種神經元喪失是通過壞死與凋亡兩條途徑實現的[7］。驚厥發生時會導致興奮毒性神經元損傷的谷氨酸NMDA受體激活及細胞內鈣超載均可啟動凋亡發生[8］，故認為凋亡與驚厥性腦損傷關系密切。不僅如此，凋亡發生多少還可反映驚厥發作嚴重程度，反復多次或嚴重強直陣攣性抽搐可誘發大量細胞凋亡，因此推測凋亡不但是驚厥性腦損傷結果，更可能通過引起腦內抑制性神經元丟失，進一步增加腦組織興奮性，從而導致更嚴重的驚厥性腦損傷，故凋亡減輕與否可能直接影響驚厥性腦損傷程度。

本實驗結果表明，模型組中胞質中膠質細胞的凋亡較多，由于正常情況下膠質細胞對神經細胞提供營養、支持與保護作用，提示驚厥后海成區神經細胞失去營養供應與保護，超微結構發生紊亂，導致腦損傷的發生。通過TUNEL法觀察，模型組可見較多神經細胞核呈棕褐色陽性反應，凋亡細胞面積顯著增加，平均灰度明顯增強。而龍膽堿高、低劑量組細胞核棕褐色的陽性細胞面積較模型組明顯減少，平均灰度明顯降低，提示應用藥物后可以抑制細胞凋亡的發生，該作用可能是龍膽堿發揮腦損傷保護作用的機制之一。

[1]周戩平，鄭娜，王帆，等.熱性驚厥對大鼠行為運動及空間學習記憶的影響[J］.中華兒科雜志，2004，42(1):50.

[2]劉樹民，劉學偉，姚素媛，等龍膽堿對高熱驚厥模型大鼠所致海馬區神經細胞損傷的保護作用研究[J］.中醫藥學報，2009，37(6):11－13.

[3]姚素媛，劉學偉，劉樹民，等龍膽堿對高熱驚厥模型大鼠腦內氨基酸類神經遞質含量及海馬區GABAB、Glu受體的影響[J］.時珍國醫國藥，2009，18(12):2875 －2877.

[4]Liu－XW，Liu－SM.Gentianine protects hippocampal neurons in a ratmodel of recurrent febrile convulsion.Neural Regeneration Reseatch.2011，6(15):1130 －1135.

[5]劉學偉，曹敏，劉樹民.龍膽堿的解熱作用及機制的實驗研究，中國實驗方劑學雜志，2011，(17)24:137－140.

[6]楊志仙，秦炯，周國平，等.發育期大鼠高熱驚厥腦損傷模型的建立[J］.北京大學學報(醫學版)，2002，34(3):225.

[7]帥海平，王子才.101例高熱驚厥患兒的轉歸[J］.實用兒科臨床雜志，2003，18(9):724 －725.

[8]史東葵，晏勇，王學峰，等.點燃鼠癲性發作對神經元凋亡的影響[J］.臨床神經學雜志，2000，13(2):76.