苦參堿對(duì)人成纖維樣滑膜細(xì)胞生長(zhǎng)的影響＊

蔣 紅，雷佳紅，，何 城，郭曉蘭，2，，楊明輝，蔡 燕，2，△（川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院：.風(fēng)濕免疫研究所；2.檢驗(yàn)科，四川南充 67000 ；.川北醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)系，四川南充 67007）

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎為特征的慢性全身性自身免疫疾病，主要臨床表現(xiàn)為慢性、對(duì)稱性、多滑膜關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)外病變，常累及全身多個(gè)系統(tǒng)，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量。RA在國(guó)內(nèi)發(fā)病率約為0.3%～0.4%，女性發(fā)病率高于男性［1］。目前臨床上多采用甲氨蝶呤、環(huán)磷酰胺等抗腫瘤藥物，阻斷淋巴細(xì)胞刺激因子的Kineret、腫瘤壞死因子阻斷劑英利昔單抗等生物制劑治療RA患者，雖然這些藥物療效明顯，但都有不良反應(yīng)多或價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)，增加了患者的痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。研究顯示人成纖維樣滑膜細(xì)胞的過度增生和分泌在RA的發(fā)病和發(fā)展中具有重要作用［2］。本研究擬從中醫(yī)中藥的角度研究苦參堿對(duì)人成纖維樣滑膜細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，探討苦參堿對(duì)RA的潛在治療作用。

1 材料與方法

1.1 人成纖維樣滑膜細(xì)胞 采集2013年1～8月川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院風(fēng)濕科收治的7例RA患者關(guān)節(jié)積液標(biāo)本，體外原代培養(yǎng)人成纖維樣滑膜細(xì)胞。7例患者中男2例、女5例；年齡36～60歲，平均50.4歲。

1.2 儀器與試劑 生物安全柜（安泰公司）；HF90CO2培養(yǎng)箱（力康公司）；IX71倒置顯微鏡（日本OLYMPUS）；酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio－RAD）。DMEM 培養(yǎng)基（美國(guó) Gibco）；胎牛血清（杭州四季青）；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）、二甲基亞砜（美國(guó)Sigma）；胰蛋白酶（美國(guó) Amresco）；苦參堿（每瓶100mg，購(gòu)自南京替斯艾么中藥研究所，純度大于98.0%），配制濃度為0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mg／mL的藥物備用。

1.3 方法

1.3.1 人成纖維樣滑膜細(xì)胞培養(yǎng) 無(wú)菌采集患者關(guān)節(jié)腔積10～30mL，1 000 r／min離心10min，棄上清后用磷酸鹽緩沖液（PBS）重懸沉淀，經(jīng)100目篩網(wǎng)過濾，將濾液以1 000 r／min離心10min，再以PBS清洗沉淀2次后，以含10%胎牛血清及青霉素和鏈霉素各100U的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞，按1×107接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。3d后觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，視情況進(jìn)行傳代，一般于培養(yǎng)后10d可取第3～5代細(xì)胞按（1～5）×1 000 個(gè)／孔接種至2個(gè)96孔板中備用，每塊板上每個(gè)藥物濃度接種6個(gè)孔，設(shè)只加培養(yǎng)液的空白組和不加藥物處理的對(duì)照組。每位患者均重復(fù)檢測(cè)3次。

1.3.2 藥物處理 96孔板中細(xì)胞培養(yǎng)24h后，以培養(yǎng)基稀釋藥物，將濃度為0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mg／mL苦參堿分別加入相應(yīng)培養(yǎng)孔中繼續(xù)培養(yǎng)。分別于藥物處理24、48h后用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。

1.3.3 MTT法檢測(cè) 培養(yǎng)24、48h后，每孔加入5mg／mL的MTT 20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄上清液，每孔加入150μL二甲基亞砜，室溫振蕩10min，在酶標(biāo)儀上測(cè)定490nm處吸光度值（A值）。每孔減去空白對(duì)照A值均值后計(jì)算每組平均數(shù)，抑制率（%）＝（1－處理組A值／對(duì)照組A值）×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用軟件SPSS16.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，平均數(shù)以表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05表示比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果 7例患者的關(guān)節(jié)滑液經(jīng)處理后均成功獲得大量成纖維樣細(xì)胞，經(jīng)鑒定該細(xì)胞為CD68陰性細(xì)胞［3］，即人成纖維樣滑膜細(xì)胞，傳代至第3～5代時(shí)90%以上細(xì)胞為該類細(xì)胞。人成纖維樣滑膜細(xì)胞多為長(zhǎng)梭形，胞質(zhì)透亮、均勻，細(xì)胞輪廓清晰，見較多分裂期細(xì)胞，表明細(xì)胞狀態(tài)良好，適合后續(xù)研究。

2.2 苦參堿處理后細(xì)胞形態(tài)變化 苦參堿作用于細(xì)胞后，細(xì)胞的數(shù)量減少，細(xì)胞間的連接減少乃至消失，胞體變小，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見大量空泡樣結(jié)構(gòu)，并隨著藥物濃度的增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，空泡增加。見圖1。

圖1 不同濃度苦參堿處理后的人成纖維樣滑膜細(xì)胞形態(tài)（×200）

2.3 MTT法檢測(cè)結(jié)果 苦參堿處理后，處理組各濃度的A值低于對(duì)照組，其中處理24h后的1.6、2.0mg／mL濃度，處理48h后1.2、1.6、2.0mg／mL濃度的 A值明顯低于對(duì)照組，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。各組細(xì)胞抑制率為2.52%～25.74%，隨藥物濃度增加和處理時(shí)間延長(zhǎng)，抑制作用增強(qiáng)。見圖2。

表1 苦參堿對(duì)人成纖維樣滑膜細(xì)胞生長(zhǎng)的影響（）

表1 苦參堿對(duì)人成纖維樣滑膜細(xì)胞生長(zhǎng)的影響（）

注：＊表示與對(duì)照組比較的t、P值。

組別24h A值 t＊ P＊48h A值 t＊ P＊對(duì)照組（mg／mL）0.522 0 ±0.057 0 處理組（mg／mL）0.4 0.507 1 ±0.077 4 0.334 0.744 0.504 0 ±0.064 3 0.553 0.590 0 .8 0.475 9 ±0.078 5 1.121 0.284 0.485 3 ±0.057 3 1.199 0.254 1 .2 0.456 0 ±0.079 6 1.613 0.133 0.440 4 ±0.064 6 2.505 0.028 1 .6 0.428 9 ±0.079 1 2.304 0.040 0.402 6 ±0.072 3 3.429 0.005 2 .0 0.412 9 ±0.074 6 2.797 0.016 0.387 6 ±0.074 3 0.520 2 ±0.006 9 3.796 0.003

圖2 不同濃度苦參堿對(duì)人成纖維樣滑膜細(xì)胞增殖的影響

3 討 論

RA是目前臨床上比較常見的一種自身免疫性疾病，病因復(fù)雜。研究表明人成纖維樣滑膜細(xì)胞過度增生和分泌是RA發(fā)病的重要基礎(chǔ)，參與關(guān)節(jié)的炎性反應(yīng)和關(guān)節(jié)破壞。人成纖維樣滑膜細(xì)胞可表現(xiàn)出轉(zhuǎn)化細(xì)胞的特征，呈類腫瘤細(xì)胞樣異常增殖，侵入到軟骨和軟骨下的骨質(zhì)，并產(chǎn)生炎性介質(zhì)、促炎性細(xì)胞因子及抗炎性細(xì)胞因子、分泌基質(zhì)金屬蛋白酶等。因此抑制人成纖維樣滑膜細(xì)胞的增殖和活化是目前研究RA的熱點(diǎn)，可能為臨床上治療RA提供新的思路或靶點(diǎn)。

苦參堿是苦參根部分離的一種生物堿，具有抗腫瘤、抗病毒、抗心律失常、抗炎等作用［4］。其不良反應(yīng)較少，目前主要用于抗病毒性肝炎治療。研究發(fā)現(xiàn)苦參堿能抑制食管癌、胃癌SGC－7901細(xì)胞、前列腺癌 PC－3M 細(xì)胞等腫瘤細(xì)胞的增殖［5－7］。人成纖維樣滑膜細(xì)胞具有腫瘤細(xì)胞樣異常增殖的特性，故本研究擬探討苦參堿是否能影響人成纖維樣滑膜細(xì)胞的生長(zhǎng)。結(jié)果表明，人成纖維樣滑膜細(xì)胞經(jīng)不同濃度的苦參堿處理后，細(xì)胞生長(zhǎng)均受到不同程度的抑制，隨著藥物濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制作用增強(qiáng)。其中處理24h后的1.6、2.0mg／mL濃度，處理48h后1.2 、1.6、2.0mg／mL濃度，與對(duì)照組細(xì)胞的A值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。提示苦參堿能抑制人成纖維樣滑膜細(xì)胞的增殖。

滑膜增生是RA的特征性病理表現(xiàn)，增生的滑膜可形成血管翳依附于軟骨表面，介導(dǎo)骨和軟骨的破壞，人成纖維樣滑膜細(xì)胞凋亡不足與滑膜增生有關(guān)［8］。介導(dǎo)人成纖維樣滑膜細(xì)胞凋亡可能是治療RA的有效途徑。有研究顯示，苦參堿能誘導(dǎo)宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與抑制survivin基因的表達(dá)有關(guān)［9］。李海軍等［10］發(fā)現(xiàn)苦參堿能通過上調(diào)Fas蛋白的表達(dá)促進(jìn)乳腺癌 MCF－7細(xì)胞凋亡。而范悅等［11］研究提示苦參堿能誘導(dǎo)肝癌HepG2發(fā)生自噬作用。自噬和凋亡均可導(dǎo)致細(xì)胞死亡、細(xì)胞數(shù)目減少，本研究通過光鏡和MTT法檢測(cè)苦參堿對(duì)人成纖維樣滑膜細(xì)胞的生長(zhǎng)具有抑制作用，但細(xì)胞數(shù)目的減少是自噬還是凋亡導(dǎo)致的結(jié)果有待進(jìn)一步探討。總之，苦參堿可影響人成纖維樣滑膜細(xì)胞的生長(zhǎng)，可作為治療RA的潛在藥物。

［1］田東林，潘磊，高國(guó)衛(wèi)，等.類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎治療研究進(jìn)展［J］.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，15（11）：137－139.

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