新靶點CyclinE干擾RNA真核表達載體的構建＊

渠志臻，劉 珊，王艷艷，高乃康，呼格吉樂△（內蒙古醫科大學附屬醫院：.檢驗科；.神經外科，呼和浩特 00050）

人腦膠質細胞瘤是人類中樞神經系統中最為常見的腫瘤之一，其侵襲性能力強，增值速率快，導致預后極差［1］。尤其是膠質母細胞瘤，惡性程度最高，其發病的機制目前仍尚未明確，而且不能像甲胎蛋白、、前列腺特異抗原（PSA）、人附睪蛋白4（HE4）等作為常用、有效的腫瘤標志物［2－3］。許多細胞周期調控的基因發生改變是正常的人腦膠質細胞和膠質瘤細胞的最大區別，細胞周期蛋白E（CyclinE）便是其中的一種。CyclinE在人腦膠質瘤中表達，與細胞周期蛋白質依賴激酶結合促進pRB的磷酸化，并且和細胞周期蛋白依賴激酶抑制因子家族的基因結合在一起形成復合物，促進細胞周期從G1到S進程繼續下去。CyclinE過量表達會使G1期縮短，導致細胞提前進入S期，干擾細胞核核酸的復制和分裂，促進腫瘤的形成［4－5］。因此CyclinE表達下調的研究對臨床工作就有十分重要的意義，每個基因都不是單獨存在的、并且發揮作用的，CyclinE表達的下調會對哪些基因的表達和功能造成影響還需要去研究。干擾RNA技術能夠特異的使基因沉默，近年來作為一個常規試驗已在研究腫瘤基因的多個領域被應用。本研究利用RNA干擾技術設計并構建了新的CyclinE干擾RNA真核表達載體，用雙酶切和堿基序列測定的方法鑒定，用Lipofectamine 2000轉染4個成功構建的載體到膠質瘤細胞，通過檢測轉染后的CyclinE mRNA表達量，篩選出干擾效果最好的1個載體，為后續在CyclinE沉默后用雙向電泳技術研究蛋白質組學的變化以及用基因芯片技術研究轉錄水平變化奠定試驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料來源 人腦膠質瘤U251細胞株購自中國科學院上海細胞庫；DNA內切酶、DNA連接酶購自 MBI公司；Lipofectamine 2000轉染試劑盒購自上海英駿公司；DNA凝膠回收試劑盒、瓊脂糖等購自天根生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 新靶點CyclinE干擾RNA的構建

1.2.1.1 干擾載體的靶序列 根據siRNA設計原則和Gene－Bank中搜索的CyclinEcDNA序列，設計并合成4對siRNA，靶序列即干擾部位如下，PCyclinE－1：5′－GGA TGG TTC CAT TTG CCA TGG －3′；PCyclinE－2：5′－GCT TCG GCC TTG TAT CAT TTC－3′；PCyclinE－3：5′－GCC AGC CTT GGG ACA ATA ATG－3′；PCyclinE－4：5′－GCC CTT AAG TGG CGT TTA AGT－3′。同時設立陰性對照（NC）。siRNA正義鏈模板的5′端添加了CACC，與BbsⅠ酶切后形成的黏端互補；反義鏈模板的5′端添加了GATC，與BamHI酶切后形成的黏端互補。將載體模板退火后，轉到JM109感受態細胞中。

1.2.1.2 干擾載體的檢驗 把所提取的質粒用BamHⅠ、PstⅠ進行雙酶切鑒定。正確的重組載體不會被PstⅠ切開但是會被BamHⅠ切開。酶切結果正確的質粒用堿基序列測定的方法鑒定載體構建成功與否。

1.2.2 干擾質粒對 U251細胞的穩定轉染 按照Lipofectamine 2000轉染試劑說明書，把經過鑒定正確的質粒和脂質體混合后分別加入U251細胞中混合培養，48h后在熒光倒置顯微鏡下觀察試驗結果。

1.2.3 反轉錄－聚合酶鏈反應（RT－PCR） 檢測各組 CyclinE－mRNA的含量提取細胞總RNA，進行RT－PCR反應，CyclinE上游引物為5′－ACC AGT TTG CGT ATG TGA C－3′，下游引物為5′－CTG CTC TGC TTC TTA CCG－3′，擴增產物為 583 bp。GAPDH 上游引物為5′－CGG GAA ACT GTG GCG TGA T－3′，下游引物為5′－GAG TGG GTG TCG CTG TTG A－3′擴增產物為300bp。

1.3 統計學處理 采用SPSS13.0統計軟件進行分析。計量資料以表示，比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 酶切和測序結果 雙酶切檢測和堿基序列測定結果表明，所有的CyclinE真核表達載體以及陰性對照載體均與所設計的序列完全相同，并且沒有發現任何異常存在。

2.2 RT－PCR檢測穩定轉染干擾RNA真核表達載體后CyclinE mRNA水平 各基因目的片段平均IDV與GAPDH基因的IDV比值（IDV CyclinE／IDV GAPDH）即為目的基因的相對DNA 水平：各組依次分別為0.590±0.013，0.530±0.008，0.130±0.004，0.390±0.011，0.580±0.007，0.280±0.013。對各組數據進行t檢驗得到PNC－U251、PCyclinE－1－U251、PCyclinE－2－U251、PCyclinE－3－U251、PCyclinE－4－U2515標本中，PCyclinE－1－U251、PCyclinE－2－U251、PCyclinE－4－U251與對照相比，mRNA水平（以灰度計算）差異均有統計學意義（P＜0.05），且PCyclinE－1－U251與 PCyclinE－2－U251、PCyclinE－4－U251之間mRNA水平（以灰度計算）的差異亦有統計學意義（P＜0.01），見圖1。

圖1 RT－PCR檢測

2.3 倒置熒光顯微鏡觀察CyclinE干擾RNA真核表達載體瞬時轉染結果 轉染24h后，在倒置熒光顯微鏡下觀察各組細胞，除未轉染的組別外都有綠色熒光蛋白表達。

3 討 論

RNA干擾的原理是21～25bp的小干擾RNA（siRNA）通過和Dicer酶等復合物的一系列作用使得同源序列mRNA發生降解［6］。干擾RNA技術能夠特異的使基因沉默，近年來作為一個常規試驗已在研究腫瘤基因的多個領域被應用。如腫瘤細胞中基因的改變引起侵襲能力、生長速率、細胞凋亡水平變化的研究［7－8］；在新抗腫瘤藥中的研究［9］；以及腫瘤在早期發生、發展時異常變化等研究［10］。

CyclinE在人腦膠質瘤中表達，而且CyclinE過量表達會使會使得G1期縮短，導致細胞提前進入S期，干擾細胞核核酸的復制和分裂，造成腫瘤的形成。腫瘤的形成并非是某個基因的作用，因此CyclinE不是單獨存在并且發揮作用的，CyclinE表達下調會影響許多基因的表達和細胞的功能。很有可能這些基因在膠質瘤的形成和發展中起著非常重要的作用。所以本研究利用RNA干擾技術使CyclinE沉默，并且沉默效果明顯，為后續在CyclinE沉默后用基因芯片技術研究轉錄水平變化以及用雙向電泳技術研究蛋白質組學的變化奠定一定基礎。

蛋白質組學是在蛋白質整體水平上對腫瘤等疾病發生、發展等多方面進行探索的學科。利用質譜技術和雙向電泳來研究蛋白質組學，可以發現不同因素影響下的多種有意義的蛋白質差異表達，為尋找直接或間接參與腫瘤侵襲、轉移等過程的多種關鍵蛋白質分子開拓思路。目前在分析細胞蛋白質的過程中常以亞細胞蛋白質組為切入點，即把細胞核與細胞質的蛋白質分開單獨研究，減少了全細胞分析的復雜性，低豐度的蛋白質能夠很大富集，提高了其檢出的數量，使研究結果具體化。基因芯片技術是通過與一些已知的熒光染料標記核酸探針進行雜交從而得出樣品核酸分子相關信息的方法，具有高通量、高效率等優點。因此基因芯片技術在腫瘤基因差異性表達，診斷和篩選有意義的新基因等多方面研究中也得到了廣泛的應用［11］。因此，當用干擾RNA的技術使得CyclinE沉默后，再用基因芯片技術及雙向電泳來做相應的研究就可能發現更多有意義的、相關的差異表達基因和蛋白質，為膠質瘤的研究提供有價值的資料。

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