氫化可的松在細胞共培養體系中對黑素合成的影響

葉俊華 解士海 楊觀招

【摘要】目的 研究氫化可的松對人表皮共培養體系（黑素細胞與角質形成細胞）酪氨酸酶活性及黑素生成的影響。 方法 培養人表皮黑素細胞和人表皮黑素細胞與角質形成細胞共培養體系，利用四甲基偶氮唑藍(MTT)還原法測定細胞活力，測定酪氨酸酶活性，475nm 比色法測定黑素含量。 結果 10-7mol/L、10-6μmol/L和10-5mol/L氫化可的松對于黑素細胞及共培養細胞酪氨酸酶活性及黑素生成均有較強的劑量相關性增強作用， 10-6μmol/L和10-5mol/L氫化可的松與對照組相比有顯著差異（p<0.01）。結論 氫化可的松對于共培養體系酪氨酸酶活性及黑素生成有較強的劑量相關性增強作用。

【關鍵詞】 氫化可的松 黑素細胞 角質形成細胞 共培養

【Abstract】Objective To study the effects of hydrocrtison on the tyrosinase activity and melanogenesis in co-culture model of human melanocytes and keratinocytes. Methods The model of co-culture of human melanocytes and keratinocytes was cultured and MTT was used to measure the proliferation of melanocytes and the co-cultures.The tyrosinase activity and melanin content were measured. Results The melanin synthesis and tyrosinase activity were clearly enhanced by hydrocrtison in a dose-dependent manner at concentrations of 10-7mol/L、10-6μmol/Land 10-5mol/L in both melanocytes and co-cultures. 10-6μmol/Land 10-5mol/L of hydrocrtison showed statistically significant suppression (p<0.01) than the control.Conclusion Hydrocrtison exhibits a a dose-dependent enhancing effects on melanin synthesis and tyrosinase activity in co-cultures of human melanocytes and keratinocytes.

【key words 】Hydrocrtison Melanocte Keratinocyte Co-culture

【中圖分類號】R722.12 【文獻標識碼】B【文章編號】1004-4949(2014)07-0054-02

白癜風是指后天獲得的色素完全脫失的一種皮膚病，近年來其發病有上升趨勢。白癜風雖然不直接危害患者生命，但是泛發嚴重的白癜風會對患者心理產生嚴重的損害，因此針對白癜風的有效治療就很有必要，但是目前臨床尚無根治白癜風的特效療法。其發病機制涉及遺傳、免疫、黑素細胞自身死亡以及神經等多方面因素，尚無定論。臨床上無論內服還是外用糖皮質激素都可以有效治療白癜風，本研究在人表皮黑素細胞和角質形成細胞共培養體系中研究氫化可的松對于黑素合成的影響，試圖揭示糖皮質激素治療白癜風的機制。

材料和方法

1 材料：氫化可的松：購自中國藥品生物制品檢定所，氫化可的松溶解在0.1%乙醇中，-20oC保存，實驗時用培養基調制最終濃度； M154基礎培養基、角質形成細胞生長添加物購自Cascade Biologicals，胎牛血清購自杭州四季青公司，其它（氫醌、二甲基亞砜（DMSO）、10－8mol/Lα－MSH、四甲基偶氮唑藍（MTT）、1％抗生素/抗真菌溶液、1μg/mL轉移因子、中性酶、胰酶、1μg/mL 維生素E、5μg/mL 胰島素、0.6ng/mL人堿性成纖維細胞生長因子、10－9mol/L ET-1）購自Sigma公司。

2 實驗方法

2.1皮膚來源：均來源于中國青少年男性常規包皮環切術后的包皮。

2.2 黑素細胞培養：細胞培養參考以前方法進行［1］。

2.3共培養體系的建立：參見我們已報道文獻［2］,簡述如下：首先分別培養原代角質形成細胞和原代黑素細胞，取2到3代的細胞用于試驗，將培養好角質形成細胞的和黑素細胞按照2：1混和接種，共同培養，其培養基為角質形成細胞培養基和黑素細胞培養基按2：1混合而得。

2.4 MTT實驗：將共培養細胞及黑素細胞按1×104/孔接種于96孔板，氫化可的松設7個濃度（10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L、10-4mol/L、10-3mol/L），每一濃度設4個復孔，對照組直接加共培養培養基200μL，空白孔不加細胞，只加培養基，經過一定時間和條件的培養，具體可參考以前的實驗，在酶標儀490nm波長（參考波長620nm）下測量各孔吸光度值，細胞增殖率＝［（待篩物各濃度平均吸光度值－空白組平均吸光度值）/（對照組平均吸光度值－空白組平均吸光度值）］×100％。

2.5酪氨酸酶活性檢測 ［3］：將培養細胞按1×104/孔接種于96孔板，分別加入含不同濃度藥物培養基100μL，對照組只加培養基，空白組不加細胞，陽性對照為5μmol/L8-MOP（8甲氧補骨脂素），依據對培養細胞無毒性原則選取3個濃度（10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L），經過一定時間和條件的培養，具體可參考以前的實驗，在酶標儀490nm波長（參考波長620nm）下測量各孔吸光度值，酪氨酸酶活性影響率＝［（待篩物組平均吸光度－空白組平均吸光度）/（對照組平均吸光度－空白組平均吸光度）］×100％。

2.6 黑素含量測定實驗［4］：在60mm直徑的培養皿中接種培養細胞，加入含不同濃度藥物的相應培養基，對照組只加培養基，陽性對照同酪氨酸酶活性測定實驗，氫化可的松根濃度選取同上（10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L），經過一定時間和條件的培養，具體可參考以前的實驗，分光光度計下測量475nm（參比波長620nm）的吸光度，黑素含量＝［（待篩物組吸光度/細胞數的平均值）/（對照組吸光度/細胞數的平均值）］ ×100％，重復4次。

2.7 數據處理：采用SPSS12.0軟件t檢驗分析，數據以 X±s 表示。

結果

1氫化可的松對細胞活力的影響：氫化可的松在（10-9mol/L－10-5mol/L）濃度范圍內經MTT實驗驗證對所有實驗培養細胞增殖都無影響。

2氫化可的松對黑素細胞及共培養細胞酪氨酸酶活性的影響：結果見表1，氫化可的松對于實驗細胞酪氨酸酶活性呈劑量依賴性增強作用，與對照組比較均有統計學差異（p<0.05），10-6mol/L及10-5mol/L濃度的氫化可的松具有顯著差異（p<0.01），氫化可的松對于兩種實驗細胞中酪氨酸酶活性的增強無統計學差別（p>0.05）。

表1氫化可的松對黑素細胞及共培養細胞中酪氨酸酶活性影響 (n=3， X±s，％)

Table one The effects of hydrocrtison on the tyrosinase activity in co-culture system (n=3， X±s，％)

濃度 (mol/L)concentrations 黑素細胞melanocyte 共培養細胞co-culture system10-7 124.67±6.43＃ 128.82±4.91＃10-6 171.28±9.59＃＃ 165.15±6.68＃＃10-5 202.58±11.29＃＃ 199.39±8.27＃＃5μmol/L 8-MOP 176.43±7.33＃＃ 169.43±8.92＃＃注：空白對照組相應值設為100%，與空白對照組相比：＃p<0.05， ＃＃p<0.01。

1氫化可的松對黑素細胞及共培養細胞黑素含量的影響：結果見表2，氫化可的松對于實驗細胞中黑素合成呈劑量依賴性增強作用，與對照組比較均有統計學差異（p<0.05），10-6mol/L及10-5mol/L濃度的氫化可的松具有顯著差異（p<0.01），氫化可的松對于實驗中兩種細胞的黑素合成增強無統計學差別（p>0.05）。

表2氫化可的松對黑素細胞及共培養細胞中黑素合成影響 (n=3， X±s，％)

Table two The effects of hydrocrtison on melanogenesis in co-culture system (n=3， X±s，％)

濃度 (mol/L)Concentrations 黑素細胞melanocyte 共培養細胞co-culture system10-7 127.53±9.12＃ 125.69±9.35＃10-6 167.24±11.57＃＃ 166.38±8.17＃＃10-5 198.26±10.28＃＃ 191.21±10.44＃＃5μmol/L 8-MOP 171.12±8.85＃＃ 178.87±12.17＃＃注：空白對照組相應值設為100%，與空白對照組相比：＃p<0.05， ＃＃p<0.01

討 論

糖皮質激素用于治療白癜風已經超過50年，臨床療效確定，而且強效糖皮質激素激素作用強于弱效激素。其機理尚未明確。由于自身免疫紊亂以及黑素細胞抗體產生可能是白癜風發病的重要原因，糖皮質激素可能通過調節這兩方面的作用達到治療白癜風的目的。近年來一些研究同樣發現糖皮質激素還可以直接作用于黑素細胞，引起酪氨酸酶活性增加以及黑素含量增加，如劉棟［5］等研究發現氫化可的松可以增強Cloudman S91黑素瘤細胞的酪氨酸酶活性并增加其黑素合成；鄧瑞春［6］等發現氫化可的松在B16黑素瘤細胞中有類似作用，類似的結果也在A375黑素瘤細胞中發現［7］。這些說明糖皮質激素還可能通過增強黑素合成發揮作用。

隨著近年來黑素細胞培養技術的成熟，人們逐漸用人表皮黑素細胞以及更接近人體的人表皮角質形成細胞和黑素細胞共培養系統研究黑素合成轉移的過程以及各種影響因素。本試驗采用了這兩種體系進一步研究了氫化可的松對于正常人表皮黑素生成的影響，發現氫化可的松可以在一定濃度范圍內劑量依賴地提高酪氨酸酶的活性并增加黑素的合成。這個結果進一步說明氫化可的松除了通過免疫途徑外，還可通過增強黑素合成達到治療效果。

參考文獻

［1］張弘;莫令君;黎偉珍。雙花對人黑素細胞增殖及黑素合成的影響。中國熱帶醫學，2008,8（8）：1319-20

［2］ 解士海;黃壯峰;楊觀招等。氧化苦參堿對細胞共培養體系中酪氨酸酶及黑素的影響。中國熱帶醫學，2008,8（8）：1291-92

［3］Kazuhisa S,Takahisa N,Koji S,et al. Inhibitory Effects of α-Arbutin on Melanin Synthesis in Cultured Human Melanoma Cells and a Three-Dimensional Human Model.Biol. Pharm. Bul.,2004,27(4):510-514

［4］ Mun YJ, Lee SW, Jeong HW,et al. Inhibitory effect of miconazole on melanogenesis. Biol. Pharm. Bul.,2004,27(6):806-809.

［5］ 劉棟，朱文元，譚城。皮質類固醇對培養Cloudman S91 黑素瘤細胞株黑素合成的影響。臨床皮膚科雜志，2003，,32(1):3-4

［6］鄧瑞春，周勇，章金剛等，氫化可的松對B16黑素瘤細胞酪氨酸酶及黑素生成影響的研究。中國藥理學通報，2002,18（4）：433-6

［7］ 韓景濤，袁江，劉志軍。氫化可的松對A375黑素瘤細胞黑素生成的影響。中國美容醫學，2007,16（12）：1699-1700