牙周致病菌在患慢性牙周炎產婦臍帶血中的檢測

江國慶 祝軍

【摘要】目的檢測臍帶血中的5種特異性牙周致病菌。方法收集64例患有慢性牙周炎（重度）產婦臍帶血標本，采用Chelex-100法提取慢性牙周炎產婦臍帶血中的DNA,并通過PCR分別檢測臍帶血中的牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)、伴放線放線桿菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans,Aa)、具核梭桿菌(Fusobacterium nucleatum,Fn)、中間普氏菌(Prevotella intermedia,Pi)、福賽斯坦納菌(Tannerella forsythensis,Tf)5種牙周特異性致病菌。結果64例患有慢性牙周炎產婦臍帶血中牙齦卟啉單胞菌(Pg)的檢出率為31%,福賽斯坦納菌(Tf)42%,中間普氏菌(Pi)26%,具核梭桿菌(Fn)21%,伴放線放線桿菌(Aa)23%。這幾種細菌的PCR產物通過測序,結果與GenBank數據庫中的序列進行比對同源性達99%~100%。結論牙周致病菌在全身性促進因素中的遺傳因素中可能發揮著一定的作用。

【關鍵詞】慢性牙周炎；臍帶血；牙周致病菌

【中圖分類號】R722 【文獻標識碼】B【文章編號】1004-4949(2014)07-0105-01

慢性牙周炎是由牙菌斑中的微生物所引起的牙周支持組織的慢性感染性疾病，導致牙周支持組織的炎癥和破壞，如牙周袋形成、進行性附著喪失和牙槽骨吸收，最后導致牙齒的松動和被拔除，引起牙周病有局部促進因素（牙石、解剖因素、不良修復體和不良正畸治療、創傷性頜、食物嵌塞、不良習慣、牙面著色）和全身性促進因素（遺傳因素、性激素、吸煙、有關的系統疾病，精神壓力等）［1］。致病性微生物是引發牙周病必不可少的始動因素，也在全身性促進因素中的遺傳因素中起到主要作用，即母親患有慢性牙周炎，出生幼兒患有牙周炎的幾率較高，主要與母嬰傳播有關［2］。研究發現原本定植于人類口腔的牙周致病菌在臍帶血中有較高的檢出率，表明牙周致病菌通過母嬰垂直傳播導致幼兒將來患有牙周病的幾率大大提高。本研究本研究通過收集患有慢性牙周炎產婦臍帶血標本,從臍帶血標本中提取5種特異性牙周致病菌的DNA,采用特異性引物,通過PCR分別檢測牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis,Pg)、福賽斯坦納菌(Tannerella forsythensis,Tf)、中間普氏菌(Prevotella intermedia,Pi)、具核梭桿菌(Fusobacterium nucleatum,Fn)以及伴放線放線桿菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans,Aa),來探討牙周致病菌在牙周病的全身性促進因素中的遺傳因素中發揮著一定的作用。

1對象和方法

1.1研究對象：選擇2012年3月至2013年4月在新疆醫科大學第一附屬醫院產科患有慢性牙周炎的產婦64例，所有研究對象均簽署知情同意書。慢性牙周炎的診斷標準：每名入選的產婦在術前一周由牙周專科醫師測量全口牙周探診深度(probing depth,PD)和牙周附著喪失(clinical attachment loss,CAL),參照Armitage等［3］推薦的診斷標準診斷牙周炎。

1.2標本采集：由產科醫師在引產后收集臍帶血,將收集的血液放入裝有1 ml生理鹽水溶液的無菌EP管中,-80℃凍存。

1.3主要試劑：5%Chelex-100(Sigma公司,美國);蛋白酶K(上海生工生物工程有限公司);2×TapPCR Master Mix(北京博邁德科技發展有限公司);5對牙周致病菌的16S rRNA特異性引物參照文獻［4-6］由上海生工生物工程有限公司合成,分別為:牙齦卟啉單胞菌(Pg),上游引物序列5′-TGTAGATGACTGATGGTGAAAACC-3′,下游引物序列5′-ACGTCATC CACACCTTCCTC-3′,擴增的目的片段長度為197 bp,PCR反應退火溫度57.2℃;福賽斯坦納菌(Tf),上游引物序列5′-GTCGGACTAATACCTCATAAAACA-3′,下游引物序列5′-TCGCCCATTGACCAATATT-3′,擴增的目的片段長度為222 bp,PCR反應退火溫度55℃;具核梭桿菌(Fn),上游引物序列5-GGCCACAAGGGGACTGAGACA-3′,下游引物序列5′-TTTAGCCGTCACTTCTTCTGTTGG-3′,擴增的目的片段長度為183 bp,PCR反應退火溫度58.6℃;中間普氏菌(Pi),上游引物序列5′-GTGCTTGCACATTCTGGACGTCGAC-3′,下游引物序列5′-CGTCTGCAATTCAAGCCCGG GTAAG-3′,擴增的目的片段長度為923 bp,PCR反應退火溫度61.8℃;伴放線放線桿菌(Aa),上游引物序列5′-GCTAATACCGCGTAGAGTCGT-3′,下游引物序列5′-ATTTCACACCTCACTTAAAGGT-3′,擴增的目的片段長度為442 bp,PCR反應退火溫度60.7℃。陽性對照采用5種國際參考標準菌株(部分標準株由四川大學華西口腔醫院衛生部重點實驗室提供):牙齦卟啉單胞ATCC33277,中間普氏菌ATCC25611,具核梭桿菌ATCC25586,福賽斯坦納菌ATCC43037,伴放線放線桿菌ATCC29523。菌株由新疆醫科大學微生物實驗室復活。

1.4主要設備：低溫高速離心機(Thermo公司,美國),C1000型PCR擴增儀(Bio-Rad公司,美國),Gel Doc2000凝膠成像儀(Bio-Rad公司,美國),DYY-7C型電泳儀(北京六一儀器廠),HHS型電熱恒溫水浴鍋(北京博迅實業有限公司),TU-1901型紫外分光光度計(北京普析通用儀器有限公司),-80℃低溫冰箱(Thermo公司,美國)。

1.5 DNA的提取：采用Chelex-100法提取臍帶血中的DNA,用電子秤秤取100 mg臍帶血并無菌操作剪碎,放入1.5 mlEP管中,然后用移液器在上述EP管中加入150μl(50 mg/ml)Chelex-100和4μl(20 mg/ml)蛋白酶K,用移液器反復吹打混勻,再用旋渦混合器混勻10 min。水浴箱中100℃水浴10 min,冰浴1min,離心半徑5 cm,12 000 r/min離心10 min,上清液移至1.5 ml無菌EP管中,-20℃保存。

2結果

臍帶血中5種特異性牙周致病菌的檢出率:牙齦卟啉單胞菌(Pg)的檢出率為31%,福賽斯坦納菌(Tf)為42%,中間普氏菌(Pi)為26%,具核梭桿菌(Fn)為21%,伴放線放線桿菌(Aa)為23%。其中福賽斯坦納菌(Tf)的檢出率最高。

3討論

隨著現代醫學的發展，人們對牙周病的發病機制有了更深入的了解。牙周病是一種微生物感染性疾病，致病性微生物是引發牙周病必不可少的始動因素。致病微生物可以通過局部的促進因素引起牙周炎，如：牙石，牙頸部的軟垢；也可通過全身性促進因素引起牙周炎，如：遺傳因素（母嬰垂直傳播）。在牙周炎過程中，牙周病原菌及其內毒素首先誘發局部牙周組織的免疫反應產生大量的炎性介質如IL-1、TNF-α，PGE-2及牙周致病菌的抗體［7］。隨病情的進展，這些致病菌及毒素進入血液循環并達到胎盤，隨之產生更多的炎性介質［8-9］。這些牙周病原菌及內毒素和炎性介質可以通過胎盤，進入胎兒的血液循環中，如果胎兒的免疫系統不能控制這種反應，則細菌及其毒素和炎性介質擴散至全身組織器官，從而誘發幼兒將來患有牙周病的可能性。

參考文獻

［1］孟煥新.牙周病學［M］.人民衛生出版社,2008,第三版:61-78

［2］王勤濤.牙周病學［M］.人民衛生出版社,2010,第二版:95-96.

［3］Armitage GC,Wu Y,Wang HY,et al.Low prevalence of a periodontitis-associated interleukin-1 composite genotype in individuals of Chinese heritage.J Periodontol,2000,71(2):164-171.

［4］Cairo F,Gaeta C,Dorigo W,et al.Periodontal pathogens in atheromatous plaques.A controlled clinical and laboratory trial.J Periodontal Res,2004,39(6):442-446.

［5］Ashimoto A,Chen C,Bakker I,et al.Polymerase chain reaction detection of 8 putative periodontal pathogens in subgingival plaque of gingivitis and advanced periodontitis lesions.Oral Microbiol Immunol,1996,11(4):266-273.

［6］Kimura S,Ooshima T,Takiguchi M,et al.Periodontopathic bacterial infection in childhood.J Periodontol,2002,73(1):20-26

［7］Tuomainen AM,Jauhiainen M,Kovanen PT,et al.Aggregatibacter actinomycetemcomitans induces MMP-9 expression and proatherogenic lipoprotein profile in apoE-deficient mice.Microb Pathog,2008,44(2):111-117.

［8］Kang IC,Kuramitsu HK.Induction of monocyte chemoattractant protein-1 by Porphyromonas gingivalis in human endothelial cells.FEMS Immunol Med Microbiol,2002,34(4):311-317.

［9］JawieńJ.New insights into immunological aspects of atherosclerosis.Pol Arch Med Wewn,2008,118(3):127-131.