TGF-β1受體抑制劑LY2109761對成纖維細胞中PPARγ表達的影響

作者簡介：姓名：朱美抒性別：女出生年月：1979年4月職位：主治醫生 【摘要】目的 利用轉化生長因子β1(transforming growth factor,TGFβ1)受體抑制劑LY2109761作用于成纖維細胞，觀察其對細胞核內過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）表達的影響，探討其潛在的抗衰老作用。方法 體外培養人成纖維細胞，利用MTT法篩選適宜濃度的LY2109761作用于成纖維細胞，用Western-blot、RT-PCR檢測對PPARγ表達的影響。結果 TGF-β受體抑制劑LY2109761能顯著增加PPARγ的表達，并呈劑量依賴效應。與對照組相比，LY2109761處理組PPARγ的表達量明顯增多(p<0.01)；且LY2109761處理組的PPARγ基因的表達量顯著增加(p<0.01)。結論 TGFβ1受體抑制劑LY2109761可誘導PPARγ的表達增多，具有一定潛在的抗衰老作用。

【關鍵詞】 過氧化物酶體增殖物激活受體γ 轉化生長因子β 成纖維細胞

【中圖分類號】R619 【文獻標識碼】B【文章編號】1004-4949(2014)07-0121-02

過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisorne proliferator-activated receptorγ,PPARγ)系一類可以被過氧化物酶體增殖劑激活的核轉錄因子超家族，參與機體的多種病理生理功能的調控，如糖尿病、炎癥反應、細胞周期等［1-4］。近年來研究發現，PPARγ隨著年齡的增加，表達量減少［5］。PPARγ具有一定的潛在抗衰老的作用。而激活TGFβ1信號通路能引起成纖維細胞出現一系列衰老表型，而其下游機制作用因子尚不明確。本課題組前期研究證實TGF-β1和PPARγ存在負相關關系，由此我們提出TGF-β1-PPARγ調控軸的概念。本研究旨在觀察TGFβ1受體抑制劑LY2109761對PPARγ表達的影響，近一步分析 TGFβ1對PPARγ的調控。

1材料與方法

1.1材料 成纖維細胞購于中科院典型培養物保藏委員會細胞庫。胎牛血清和高糖DMEM培養基購自Gibco公司，LY2109761購自selleck公司。Trizol、Real-time PCR試劑盒、SYBR購于TAKARA公司，引物購美國Invitrogen公司。TGFβ1和PPARγ抗體均購自Santa Cruz公司，蛋白濃度檢測試劑盒購于Bio-Rad公司，全細胞裂解試劑盒購于凱基公司。

1.2細胞株培養 將成纖維細胞株接種于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基（加青霉素10U/ml和鏈霉素100U/ml），置于5%CO2、37培養箱，培養細胞至融合約為80%時出傳代，待細胞處于指數生長期是進行實驗。

1.3 方法

1.3.1 細胞增殖測定：MTT法測定。胰酶消化細胞制成細胞懸液，并調整至1.5X104/ml，每孔100μl接種于96孔板，24h后分別加入終濃度為0、0.1μM/L、0.5μM/L、1μM/L、5μM/L、10μM/L的LY2109761每組重復6孔，然后分別培養24h、48h、72h后測定OD值。

1.3.2 Western-Blot檢測相關蛋白：全細胞裂解液裂解細胞，提取蛋白，Lowery法測定蛋白濃度。加上樣buffer煮蛋白。然后依次跑膠、轉膜、封閉、一抗孵育、洗膜、二抗孵育、洗膜、顯影操作。以β-激動蛋白（β-actin）做內參。

1.3.3 RT-PCRRT-PCR提取總RNA按照相關試劑說明書進行，本實驗采用10μl體系進行反轉錄，Real-time PCR按照說明書使用20μl體系。相對表達量用 2 –△△Ct法計算，β-actin做內參。。

1.3.4 數據統計分析：數據均采用均數±標準差表示。使用spss17.0統計軟件分析，采用分析包括t檢驗和方差分析。

2 結果

2.1 細胞毒性實驗(MTT)：不同濃度的LY2109761處理成纖維細胞，隨著LY2109761濃度的增加，細胞活力降低。在藥物濃度達到5μM/L時，與對照組相比有統計學意義(p<0.05)，結果見圖1。

圖1 MTT實驗結果

2.2LY2109761 5μM/L處理細胞后PPARγ蛋白表達量及mRNA水平變化趨勢相同。成纖維細胞經LY2109761處理后，PPARγ蛋白增多，mRNA轉錄增多。差異有統計學意義(p<0.05)。結果見圖2。

B

圖2A：對照組成纖維細胞與5μM/L的LY2109761處理組中PPARγ表達量。

B：對照組成纖維細胞與5μM/L的LY2109761處理組中PPARγ的mRNA相對表達量。注：與對照組比較* p<0.05

3 討論

成纖維細胞是疏松結締組織的主要細胞成分，由胚胎時期的間充質細胞分化而來，它對不同程度的細胞變性、壞死和組織缺損以及骨創傷的修復有著十分重要的作用［6］。最新研究表明成纖維細胞可以降低年齡老化對皮膚的影響。

近年來一些新的研究發現，PPARγ隨著年齡的增加，表達量減少［5］，PPARγ具有一定的潛在抗衰老的作用。TGFβ1的激活能引起一系列的衰老表型。本研究通過TGFβ1受體抑制劑，抑制TGFβ1的功能后發現，PPARγ表達增多，且基因水平和蛋白水平表達均增多，即抑制TGFβ1信號通路的能夠增加PPARγ的表達量。TGFβ1受體抑制劑能夠增加PPARγ的表達，具有一定潛在的抗衰老作用。

參考文獻

［1］Simonin MA, Bordji K,Boyault S,etal.PPAR-γ ligands modulate effects of LPS in stimulated rat synovial fibroblasts［J］.Physiol Cell Physiol, 2002, 228:125-133.

［2］Janabi N.Selective inhibition of cyclooxygenase-2 expression by 15-deoxy-12,14-prostaglandinJ2inactivatedhuman astrocytes［J］.Immnun,2002,168:4747-4755．

［3］Hinz B, Brune Pahl A, etal.15d-PGJ2 inhibits the expression of proinflammatory genes in human blood monocytes via a PPAR-y independent mechanism ［J］.Biochem Biopsys Res Commun, 2003, 302:4l5-435.

［4］Desvergne B, Wahli W.Peroxisome proliferator-activated receptors: Nuclear control of metabolism. Peroxisome pmliferator-activated Receptors: nuclear control of metabolism ［J］.Endocr Rev, 1999, 20(5):649 – 688

［5］張秀錦,葉平,王兆君.老年大鼠PPARγ的表達及與胰島素抵抗的關系［J］.中華老年醫學雜志,2004;23(2):106-108.

［6］王英慧.成纖維細胞的生物學特性及其成骨作用的研究進展［J］.大同醫學?？茖W校學報,2006,2:30-31.