HOXA5基因真核表達質粒的構建及在乳腺癌細胞中的功能研究

倫淑敏

（天津醫科大學腫瘤醫院腫瘤研究所，國家腫瘤臨床醫學研究中心，天津市腫瘤防治重點實驗室，天津300060）

乳腺癌是全球女性發病和死亡中占第一位的惡性腫瘤，轉移是乳腺癌患者死亡的首要原因[1]。因此，發現與乳腺癌轉移相關的基因對于乳腺癌的預后評估和抗腫瘤治療提供新的診斷標志和治療靶點有重要意義。同源盒A5（Homeobox A5，HOXA5）基因廣泛表達于人體的不同組織，能夠轉錄調節多種基因的表達，研究表明，HOXA5在非小細胞肺癌及乳腺癌中起到抑制癌癥發生的作用[2-3]。然而對于HOXA5在乳腺癌轉移中的作用少有報道。本研究通過構建HOXA5的真核表達質粒并將其轉染乳腺癌細胞觀察其對乳腺癌細胞表型的影響，從而研究HOXA5在乳腺癌進展過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株和試劑 乳腺癌細胞株MCF7、BT474及MDA-MB-231均來自于美國標準生物品收藏中心。RPMI-1640培養基及胎牛血清購自美國GIBCO公司，RNA抽提試劑、Trizol、反轉錄試劑、實時定量PCR 試劑、LipofectamineTM2000及 pcDNA（3.1+）載體均購自美國Invitrogen公司，膠回收試劑盒和質粒小提試劑盒均購自美國Fomentas公司，感受態細胞CDH5購自日本TaKaRa公司，丙烯酰胺購自美國Sigma公司，HOXA5單克隆抗體購自美國Sigma公司，7500型Realtime PCR儀來自美國ABI公司。

1.1.2 細胞培養 乳腺癌細胞系MDA-MB-231、BT474及MCF7細胞來源于美國標準生物品收藏中心（American Type Culture Collection，ATCC），MDAMB-231和BT474細胞采用RPMI-1640培養液（GIBCO公司，美國），MCF7細胞采用高糖DMEM/F12培養液（GIBCO公司，美國），所有細胞于含10%胎牛血清（Fetal Bovine Serum，FBS）的培養液中，在5%CO2、37℃條件下培養。將對數生長期細胞用0.25%胰蛋白酶消化，制成單細胞懸液，用于體外和體內實驗。

1.1.3 乳腺癌細胞MDA-MB-231轉染 接種2×105個細胞/孔于6孔板，在細胞為80%～90%飽和度時用于轉染，采用LipofectamineTM 2000脂質體質粒轉染，方法按照說明書。轉染48 h后裂解細胞提取總RNA及蛋白進行下一步實驗。以轉染pcDNA3.1空質粒的細胞為陰性對照，以未轉染細胞為空白對照。

1.2 方法

1.2.1 HOXA5基因cDNA全長的克隆 取生長至80%飽和度的MCF7細胞，加入適量Trizol試劑按說明書提取細胞總RNA。20μL逆轉錄反應體系中包括5μg總RNA，反應條件為16℃30min，42℃30min，85℃5min，4℃保存。參考NCBI的HOXA5基因序列設計出1對擴增HOXA5 cDNA全基因編碼區的引物序列，上游引物：5′-GGAATTCACGACCGCGAGCCACAAATCAA-3′（5′端含 EcoR I酶切位點），下游引物 5′-CCTCGAGGCTCAGATACTCAG GGACGGA-3′（5′端含Xho I酶切位點）。以上述引物為模板進行PCR，反應條件為：94℃4min、94℃30 s、62℃30 s、72℃1min；35個循環。PCR產物行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統觀察，回收目的片段。

1.2.2 HOXA5真核表達質粒的構建及鑒定 將回收的HOXA5 cDNA和質粒pcDNA3.1同時用EcoR…和Xho…于37℃酶切過夜，電泳分離后回收目的基因片段和載體，將質粒載體與目的基因片段按摩爾比1∶8加入含DNA連接酶的20μL反應體系，16℃連接過夜。將連接產物轉化大腸桿菌DH5α，于含100μg/mL氨芐青霉素的LB固體培養基中37℃培養過夜。次日挑取單克隆菌落，200 r/min 37°C培養過夜，堿裂解法提質粒DNA，EcoR I和Xho I雙酶切鑒定并送華大基因測序驗證，確保表達框無誤。大量擴增并純化鑒定正確的重組質粒。

1.2.3 實驗分組 實驗分為3組：空白組（MDAMB-231組），未經處理的原代細胞；陰性對照組（231-Vector組），轉染pcDNA3.1陰性對照；轉染HOXA5組（231-HOXA5組），轉染 pcDNA3.1-HOXA5。

1.2.4 RT-QPCR檢測HOXA5的表達 提取總RNA并反轉錄，步驟如上。RT-QPCR反應為20μL體系，包括由40 ng總RNA反轉錄所得的cDNA。PCR反應條件為50℃2min，95℃2min，95℃30 s，62℃1min，40個循環。CT值為熒光信號達到設定閾值時所經過的循環數。計算各樣本待測基因的CT值與GAPDH的CT值的差即△CT，2-△CT則為該樣本中待測基因相對于GAPDHmRNA的表達量。

1.2.5 Western blot檢測HOXA5蛋白的表達 40μg總蛋白經聚丙烯酰胺凝膠（PAGE，4%濃縮膠、10%分離膠）80伏電壓下電泳3 h后，電轉印至PVDF膜上（濕轉70伏，3 h）。5%脫脂奶粉（pH 8.3的TBS-T配制）室溫封閉1 h后，加入一抗，4℃孵育過夜。TBS-T洗膜6次后，加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗,室溫孵育30～45min，TBS-T洗膜6次后與ECL化學發光試劑顯色1～2min，曝光X膠片。一抗：鼠抗 HOXA5 單克隆抗體（1∶1 000），β-Actin單克隆抗體（1∶5 000）。HRP標記二抗：山羊抗鼠抗體（1∶2 000&1∶10 000）。

1.2.6 細胞劃痕實驗測細胞遷移能力 以5×105/孔的細胞密度將細胞接種至6孔板中，待細胞生長至80%飽和度左右，移除培養液，在各孔中垂直劃痕，PBS清洗漂浮細胞后，繼續培養，觀察細胞遷移情況。

1.2.7 RT-QPCR檢測EMT相關轉錄因子及標志物的變化 反轉錄及RT-QPCR步驟如上，檢測3組細胞中EMT相關轉錄因子Twist、Snail、SlugmRNA表達量。

1.3 統計學方法 SPSS 17.0統計軟件進行實驗數據的整理、分析，實驗數據采用x±s表示，各組之間差異的分析用一元方差，檢測空白對照組與其余各組比較用LSD-t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 乳腺癌細胞中HOXA5的表達 在3株乳腺癌細胞MCF7、MDA-MB-231和BT549細胞中，HOXA5在MDA-MB-231中表達最低。故選擇MDA-MB-231細胞株用于后續轉染實驗（圖1）。

圖1 乳腺癌細胞中HOXA5的表達Fig1 Exp ression of HOXA5 in breast cancer cell lines

2.2 HOXA5真核表達質粒瞬時轉染乳腺癌MDAMB-231細胞鑒定 應用RT-QPCR方法鑒定表達質粒的轉染效果，轉染質粒pcDNA3.1-HOXA5的MDA-MB-231（231-HOXA5）細胞中 HOXA5mRNA的表達量約是其它兩組細胞的1 000倍。Western blot用HOXA5抗體檢測，顯示231-HOXA5的HOXA5蛋白表達增多。結果見圖2。

圖2 3組細胞中HOXA5mRNA（左）及蛋白（右）表達量Fig2 ThemRNA（Left）and the protein(Right)expression levelsof HOXA5 in MDA-MB-231,231-Vector and 231-HOXA5 cells

2.3 轉染HOXA5后乳腺癌細胞形態學改變 采用HOXA5轉染乳腺癌細胞MDA-MB-231，具有間質特性且高轉移潛能的MDA-MB-231細胞偽足顯著縮短，細胞間粘附顯著增加，細胞間連接緊密。見圖3。

圖3 3組細胞形態觀察（×200）Fig 3 The cellm orphology ofMDA-MB-231,231-Vector and 231-HOXA5 cells(×200)

2.4 HOXA5高表達后細胞遷移能力的改變 轉染空質粒的231細胞（231-pcDNA3.1）及轉染HOXA5的231細胞（231-pcDNA3.1-HOXA5），兩組細胞進行劃痕實驗。結果表明，轉染HOXA5的實驗組細胞較對照組細胞遷移能力明顯降低。見圖4。

2.5 HOXA5對EMT相關轉錄因子的影響 3組細胞分別檢測Twist、Snail、Slug 3種EMT相關轉錄因子mRNA的表達量，結果表明，過表達HOXA5后Twist的表達量明顯降低。見圖5。

圖4 劃痕實驗觀察細胞的遷移能力Fig 4 Them igration ability of the cellswereobserved by scratch assay

圖5 3組細胞中EMT相關轉錄因子的表達Fig 5 Theexpression levelsof EMT-inducing transcription factors in threegroups

3 討論

乳腺癌是一種異質性疾病，尋找乳腺癌相關癌基因及抑癌基因可為乳腺癌的診斷和治療提供生物學靶點。

同源盒基因是含有183個核苷酸序列，編碼61個氨基酸的一組高度保守的同源異構體，具有DNA結合活性[4-5]。人體內有4種HOX基因簇（HOXA-D），均可作為轉錄因子調控能夠影響細胞功能的一系列下游基因[6-7]。研究發現，HOXA5上調其直接下游靶基因視黃酸受體β的表達，通過視黃酸介導的細胞凋亡及細胞生長抑制作用，進而在抗腫瘤中發揮重要作用[8]。Golpon等[2]發現，沉默HOXA5的表達與肺癌的發生密切相關。進一步在非小細胞肺癌A549中通過micRNA抑制HOXA5的表達，可促進細胞的增殖、遷移及侵襲能力[9]。同樣，在乳腺癌發生過程中，抑制HOXA5將限制P53的表達從而致癌[3]。綜上所述，HOXA5是癌發生的抑制性因素。

本研究表明，在3株細胞系中，以MCF7中的HOXA5mRNA表達量為最高，而在MDA-MB-231細胞中，HOXA5表達量明顯低于其它細胞系。MDA-MB-231細胞是basal-like型乳腺癌細胞系，因為大多數basal-like亞型乳腺癌缺乏ER、PR及HER2的表達，所以很多研究將三陰性乳腺癌（ER-/PR-/HER-2-）定義為basal-like亞型乳腺癌。分子分型與預后有密切關系，Ihemelandu等[10]對372例乳腺癌患者隨訪的結果顯示Triple negative型乳腺癌的遠處轉移率明顯高于Luminal型和其他類型，是預測遠處轉移的獨立預后因素（P<0.05）。而HOXA5在惡性程度較高的MDA-MB-231細胞中的低表達及在惡性程度較低的luminal型乳腺癌細胞MCF7及BT474中表達量較高，提示其低表達可能與細胞的惡性程度高有關。進一步實驗結果表明，MDA-MB-231過表達HOXA5后，細胞形態發生明顯變化，由梭形變為短圓，相互之間黏附作用增加，進一步提示HOXA5可能作為抑制腫瘤細胞惡性表型的因素存在。

上皮-間質轉化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）與細胞外基質（extracellularmatrix,ECM）重塑是細胞遷移能力改變的重要機制。EMT與細胞的運動能力的改變密切相關[11]，EMT是一個可逆的轉分化過程，發生EMT的上皮細胞獲得間質細胞的特性，如運動和侵襲[12]。大量證據表明，EMT在腫瘤的進展及轉移中發揮重要作用[13]。細胞發生EMT時，上皮細胞失去極性，細胞黏附力下降，遷移和運動能力增加，上皮細胞表現出間質細胞表型[14-15]。ECM重塑是腫瘤細胞侵襲和轉移的另一關鍵環節，在腫瘤微環境中，腫瘤細胞既分泌細胞外基質組分又分泌ECM降解酶實現對ECM的重塑，為腫瘤細胞侵襲和轉移提供條件[16]。HOXA5可能通過調節以上過程調控乳腺癌細胞的轉移能力。

本實驗通過檢測EMT相關轉錄因子表達量的變化進一步探索了細胞遷移能力改變的機制，EMT相關轉錄因子，如Twist、Snail、Slug等與腫瘤的遷移侵襲密切相關。本研究檢測了EMT相關轉錄因子的mRNA表達量，結果表明，過表達HOXA5后轉錄因子Twist的表達量明顯降低，提示HOXA5能夠抑制EMT的發生。

綜上所述，HOXA5在乳腺癌細胞中起到抑制腫瘤細胞轉移的作用，可能為乳腺癌預后及治療提供新的分子標志，關于介導HOXA5抑制轉移的下游靶點及具體機制還需進一步研究。

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