雙聯抗血小板藥物對大鼠小腸的損傷及其機制

田珺琪 ，張志廣 ，李 熳 ，劉 霞 ，張雪蓮 ，陸 偉

（1.天津醫科大學第二醫院消化科，天津300211；2.天津市第二人民醫院消化科，天津 300192）

抗血小板藥物目前廣泛用于預防及治療心血管疾病，已經逐漸成為臨床上用于治療血栓、栓塞的基石[1-3]。大量臨床研究已證實抗血小板治療對血栓栓塞性疾病一級和二級預防的益處[4]。但由于抗血小板藥物的廣泛應用，其消化道不良事件也日益增多[5-7]。近年來,隨著膠囊內鏡和雙氣囊小腸鏡檢查的普及，越來越多的研究不再局限于其對胃的損傷，而開始關注并已證實抗血小板藥物所致小腸損傷也不在少數。已有研究發現在使用非甾體類抗炎藥 （non-steroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs）患者中，NSAIDs相關的小腸損傷程度甚至超過了胃損傷[8]。本實驗旨在大鼠體內研究抗血小板藥物對小腸的損傷，并探討可能機制，以期為臨床的預防及治療提供實驗室依據。

1 材料與方法

1.1 材料 健康SD大鼠80只（天津醫科大學藥學院動物房提供）；阿司匹林腸溶片（拜耳醫藥保健有限公司）；氯吡格雷片（天津騰麟發展有限公司）；即用型SP免疫組化通用試劑盒（天津市津脈基因測繪技術有限公司）；兔抗大鼠多克隆抗體TNF-α抗體、兔抗大鼠多克隆抗體IL-1β抗體（武漢博士得生物工程有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 將80只大鼠隨機分為4組，每組20只。A組：陰性對照組；B組：阿司匹林組；C組：氯吡格雷組；D組：阿司匹林聯合氯吡格雷組。

1.2.2 動物造模 4組分別予以生理鹽水、阿司匹林10.41mg/kg、氯吡格雷7.81mg/kg、阿司匹林10.41mg/kg聯合氯吡格雷7.81mg/kg灌胃，1次/d，連續14 d,以上所有大鼠每次灌胃液體量均按10 mL/kg計算。造模期間大鼠均正常飲食飲水。

1.2.3 標本制備 末次灌胃后所有大鼠禁食不禁水18 h，以10%水合氯醛3mL/kg行腹腔注射麻醉，分離全段腸系膜，沿腸系膜對側剖開全部小腸，PBS沖洗干凈，觀察大鼠腹腔粘連情況及小腸損傷情況；于距回盲部40 cm處取近側端空腸1 cm，PBS沖洗干凈后，置4%甲醛液中固定，常規石蠟包埋，切片厚度4μm，行免疫組化檢測腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor－α，TNF－α）和白細胞介素－1β（interleukin－1β，IL－1β）的表達。

1.2.4 檢測指標

1.2.4.1 小腸黏膜大體觀察及損傷評分：沿腸系膜對側切開小腸，PBS沖洗干凈后,于解剖顯微鏡下觀察，按照修改后的Reuter方法進行小腸損傷情況評分。潰瘍評分標準：未見明顯損傷為0分；局灶性充血，但未見潰瘍形成為1分；有潰瘍形成，但無充血及腸管增厚為2分；潰瘍形成伴炎癥反應（1處）為3分；潰瘍形成伴炎癥反應（2處及2處以上）為4分；出現穿孔為5分。粘連評分標準：腸管無粘連計0分，輕度粘連（易解除）計1分,明顯粘連計2分。損傷總分為潰瘍評分與粘連評分之和。

1.2.4.2 免疫組化法檢測小腸黏膜TNF-α、IL-1β表達：采用SABC法（按試劑盒說明書）。主要步驟:石蠟切片常規脫蠟至水、枸櫞酸鹽緩沖液中，于微波爐中低火修復抗原，3%H2O2封閉內源性過氧化物酶 15min，滴加一抗（TNF-α、IL-1β 均為 1∶200稀釋），4℃過夜，37℃復溫1 h，滴加生物素標記二抗工作液，37℃溫箱中孵育30min，PBS沖洗，DAB顯色3～4min，鏡下控制顯色時間，蘇木精復染、脫水、透明、中性樹膠封片。用PBS代替一抗作為空白對照。定性判定:（1）依據陽性細胞數量計分:陽性細胞數<10%,計0分；陽性細胞數10%～25%,計1分；陽性細胞數為26%～50%,計2分；陽性細胞數為51%～75%,計 3 分；陽性細胞數>75%,計 4 分；（2）依據細胞著色強度計分:無色為0分；淡黃色為1分；棕黃色為2分；褐色為3分；（3）陽性細胞數量和著色強度兩項得分相加即為最后得分。

1.3 統計學方法 采用SPSS 17.0軟件對數據進行統計分析。計量資料以x±s表示，因各組樣本含量相等，故多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠小腸黏膜大體表現及損傷評分 對照組大鼠小腸組織未見明顯損傷；阿司匹林組可見腸管粘連、水腫，黏膜充血、糜爛、潰瘍；氯吡格雷組腸管粘連、水腫不明顯，黏膜可見少量散在點狀糜爛及小潰瘍；雙抗組腸管粘連、水腫、擴張明顯，黏膜可見多處散在充血、糜爛及片狀潰瘍。各實驗組損傷評分明顯高于對照組（P＜0.01）；阿司匹林組較氯吡格雷組損傷評分高（P＜0.01），雙抗組較阿司匹林組和氯吡格雷組損傷評分均明顯升高（P＜0.01）（表 1）。

表1 各組大鼠小腸黏膜損傷評分(x±s，n=20)Tab1 The injury scores of rats’sm all intestinalm ucosa in each group(x±s，n=20)

2.2 小腸黏膜TNF-α、IL-1β蛋白免疫組織化學染色 根據免疫組織化學染色結果，TNF-α表達于細胞漿，呈黃色或棕黃色；IL-1β主要表達于細胞漿，呈黃色或棕黃色（圖1）。

2.3 小腸黏膜TNF-α、IL-1β的表達水平 各實驗組小腸黏膜中TNF-α、IL-1β均較對照組呈顯著高水平表達（P<0.05），且阿司匹林組與氯吡格雷組相比呈高水平表達（P<0.05），雙抗組較單用阿司匹林、單用氯吡格雷亦呈明顯高水平表達（P<0.05）（表2）。

表2 各組大鼠小腸黏膜TNF-α、IL-1β表達水平(x±s，n=20)Tab2 The expression levels of TNF-α and IL-1β in rats’small intestinalmucosa of each group(x±s，n=20)

4組之間分別兩兩比較TNF-α、IL-1β表達水平，差異均有統計學意義（P＜0.05）

圖1 各組大鼠小腸黏膜TNF-α（上）、IL-1β（下）表達Fig 1 Theexpressionsof TNF-α and IL-1β in rats’small intestinalmucosa of each group

3 討論

近年來抗血小板藥物在心腦血管疾病的治療中發揮著越來越重要的作用，已成為心腦血管疾病的一級、二級預防藥物。多項大規模研究的結果證實阿司匹林聯合氯吡格雷的雙聯抗血小板治療可降低患者近期和遠期的心血管風險，同時也發現其會增加患者出血、尤其是胃腸道出血的風險[9-10]。有研究表明，長期服用阿司匹林的患者消化道潰瘍的發生率約為1%～2%[11]；聯合應用阿司匹林和氯吡格雷可使消化道出血的風險增加7～14倍[12-13]。雖然目前對NSAIDs引起上消化道不良反應的研究較多，但對阿司匹林和（或）氯吡格雷的雙抗或單抗治療與消化系統損傷的研究甚少，尤其是其所致的小腸損傷。

目前阿司匹林是臨床應用最廣泛的抗血小板藥物，為NSAIDs的經典代表，其對消化道的可能損傷機制包括:（1）局部作用，即其對消化道黏膜有直接的刺激作用，可作用于胃黏膜的黏液－碳酸氫鹽層，破壞胃黏膜的保護屏障；（2）全身作用，阿司匹林可使環氧合酶活性中心的絲氨酸乙酰化，抑制胃黏膜環氧合酶活性而使前列腺素（prostaglandin，PG）合成減少。而PG可以增加胃黏膜血流量，并刺激黏液和碳酸氫鹽的合成及分泌，促進上皮細胞增生，從而對胃黏膜起保護作用。氯吡格雷為新型抗血小板藥物，常與阿司匹林合用治療心腦血管疾病，是血小板表面二磷酸腺苷（adenosinediphosphate,ADP）受體拮抗劑,為不具抗血小板活性的前體藥物，其活性代謝產物發揮抗血小板聚集作用[14]，可抑制血小板釋放促血管生長因子，如血管內皮生長因子，從而導致新生血管形成障礙，使胃腸受損傷黏膜修復受阻[15]。因此，認為氯吡格雷不是潰瘍產生的直接原因，而是通過抑制血小板聚集及新生血管形成而阻礙潰瘍愈合，誘發已存在的無臨床癥狀的潰瘍出血。尚無確切證據表明氯吡格雷具有獨立的損傷胃腸道黏膜的作用。

隨著臨床上膠囊內鏡和雙氣囊小腸鏡的廣泛應用，抗血小板藥物對小腸的損傷逐漸受到關注。Lanas等[16]認為NSAIDs所致的遠端消化道損傷同樣常見,甚至更加普遍。亦有研究發現外源性PGs并不能阻斷NSAIDs誘導的小腸損傷[17]，因此認為NSAIDs相關小腸損傷的發生并不是單純通過抑制PGs合成來實現的。

近年來炎癥反應在小腸損傷中的作用逐漸受到廣泛關注。TNF-α是機體受內外環境刺激后產生的具有重要生物學功能的細胞調節蛋白，參與機體的免疫、炎癥、抗感染等過程。單核細胞或巨噬細胞合成白細胞介素－1（interleukin－1，IL－l）前體，然后裂解產生成熟的具有生物活性的IL-1，按其結構分IL-α和IL-1β兩種，其中IL-1β是重要的炎癥介質，在機體的炎癥反應中起重要作用。

我們用標準劑量阿司匹林、氯吡格雷灌服大鼠，免疫組化法測定TNF-α、IL-1β在大鼠小腸黏膜的表達，結果顯示各實驗組小腸黏膜中TNF-α、IL-1β均較對照組呈顯著高水平表達，且阿司匹林組與氯吡格雷組相比呈高水平表達，雙抗組較單用阿司匹林、單用氯吡格雷組亦呈明顯高水平表達，這提示炎癥因子TNF-α、IL-1β參與了小腸黏膜的損傷，并在其發病機制中有一定意義。

綜上所述，筆者認為阿司匹林、氯吡格雷致小腸損傷的前期機制可能不同，阿司匹林可主動引起潰瘍形成，而氯吡格雷可能使血管形成受阻，導致已有潰瘍難以愈合，兩者最終均引起炎癥因子TNF-α、IL-1β不同程度地釋放，導致小腸黏膜損傷。但本實驗僅在一定程度上說明了炎癥反應參與了抗血小板藥物所致大鼠小腸的損傷，而是否與其他損傷機制共同作用導致小腸損傷還有待進一步研究。只有明確所有可能的損傷機制才有助于指導臨床醫師更好地應用抗血小板藥物并預防和治療相應的消化道損傷。

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