Nrf2在富氫液減輕小鼠膿毒癥氧化損傷中的作用

高秋文，謝克亮，陳紅光，王衛娜，王國林，于泳浩

（天津醫科大學總醫院麻醉科，天津300052）

膿毒癥（sepsis）是感染因素誘發的全身炎癥反應綜合征，是燒傷、創傷和大手術等的常見并發癥，是危重癥患者死亡的首要因素[1]。氧化應激在膿毒癥的發病過程中發揮重要的作用[2]。近年來研究發現，氫氣及富氫液可提高膿毒癥小鼠的生存率、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）和過氧化氫酶（catalase,CAT）的活性，減少丙二醛（malondialdehyde，MDA）的表達，為膿毒癥的救治研究提供新的方向[3-5]。核因子E2相關因子2（Nrf2）是氧化應激啟動內源性保護反應的關鍵因素，是CNC（cap’n’collar）轉錄因子家族成員中活力最強的轉錄調節因子，亦是膿毒癥發生發展的關鍵調節因子[4]。Thimmulappa等[6]研究發現，Nrf2基因敲除的膿毒癥小鼠生存率遠遠低于野生型膿毒癥小鼠。本研究擬探討Nrf2在富氫液減輕小鼠膿毒癥氧化損傷中的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 動物選擇及分組 野生型雄性C57BL/6小鼠64只，購自中國軍事醫學科學院實驗動物中心。體質量20～25 g，5周齡，適應性觀察1周后，采用隨機數字表法，將其隨機分為4組（n＝16）：假手術組（A組）、膿毒癥組（B組）、膿毒癥+富氫液組（C組）、膿毒癥＋富氫液+反義維甲酸（antisense retinoic acid，ATRA）組（D組）。

1.2 重度膿毒癥小鼠模型的建立及ATRA的處理 按照參考文獻[5]方法麻醉、備皮和鋪單。沿腹中線切開皮膚、腹壁約1 cm，在回盲瓣下方盲腸近段1/4處結扎盲腸（避免結扎回腸及盲腸系膜血管），用20 G無菌針頭行被結扎盲腸穿孔，然后擠壓盲腸，使其內容物沿穿孔部位擠出0.2～0.3mL，將盲腸和擠出內容物一起送回腹腔，逐層縫合腹壁切口。A組只進行相同的操作，不進行盲腸結扎和穿孔。參考文獻[7]及前期實驗結果，選擇ATRA為Nrf2抑制劑，在盲腸結扎穿孔（cecal ligation and puncture，CLP）實驗前1周，每天腹腔注射ATRA，10mg/kg（Sigma-Aldrich），ATRA溶于玉米油中。

1.3 富氫液的制備及應用 按照參考文獻[4]方法并加以改進，將生理鹽水置于高純氫氣（純度>99.999 9%）環境中，在0.4MPa壓力下加壓暴露4 h，至氫氣溶解于生理鹽水達到飽和狀態，放于4℃貯存、備用。為了保證生理鹽水中氫氣濃度，每次使用富氫液新鮮制備，氣相色譜法檢測氫濃度大于0.6mmol/L。C和D組于CLP術后1、6 h分別腹腔給予富氫液5mL/kg，而A組給予同等劑量的生理鹽水。

1.4 生存率觀察 每組取10只小鼠，觀察實驗后7 d內小鼠生存情況。

1.5 血清MDA、抑制·OH能力、SOD和CAT水平的測定 每組取6只小鼠，于假手術或CLP 24 h后，采集下腔靜脈血樣1.5mL，4℃3 000×g離心15 min，取血清，采用722可見分光光度計（上海分析儀器廠）測定MDA、·OH、SOD和CAT（試劑盒購自南京建成生物工程研究所，中國）。

1.6 Western blot方法測定Nrf2的表達 于實驗后24 h，每組隨機取6只小鼠，下腔靜脈采血后處死，取兩肺中葉，用組織裂解液裂解細胞，離心取上清后進行蛋白定量。取50μg蛋白進行10%SDSPAGE凝膠電泳，以半干法點轉移轉膜、封閉后，用Nrf2 單克隆抗體（稀釋度 1∶200，Santa Cruz公司，美國）進行孵育，漂洗后加入辣根過氧化物酶標記的二抗（稀釋度 1∶5 000，Sigma公司，美國）。在暗室中以增強化學發光液進行顯色、曝光，采用Bio-Rad圖像分析系統（Bio-Rad公司，美國）進行掃描，以目的蛋白條帶積分光密度值與內參β-actin條帶積分光密度值的比值反映目的蛋白表達水平。

1.7 統計學處理 采用SPSS 18.0統計學軟件進行分析，計量資料以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析，，生存率比較采用Kaplan-Meier法分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 與A組比較，B組小鼠7 d生存率降低（P<0.05）；與B組比較，C組小鼠7 d生存率升高（P<0.05），與C組比較，D組小鼠7 d生存率顯著下降（P<0.05），見表 1。

表1 4組小鼠Sham或CLP后不同時點生存率的比較（n=10，%）Tab1 Com parison of survival ratesat different tim eafter Sham or CLP operation(n=10,%)

2.2 與A組比較，B組血清MDA含量增加，抑制·OH能力、SOD和CAT活性降低（P<0.05）；與B組比較，C組血清MDA含量降低，抑制·OH能力、SOD和CAT活性增加（P<0.05）；與C組比較，D組血清MDA含量增加，抑制·OH能力、SOD和CAT活性降低（P<0.05），見表 2。

表2 小鼠血清MDA、抑制·OH能力、SOD和CAT活性的比較（n=6）Tab2 Com parison of MDA,inhibition of·OH,SOD and CAT activity in blood ofm ice(n=6)

表2 小鼠血清MDA、抑制·OH能力、SOD和CAT活性的比較（n=6）Tab2 Com parison of MDA,inhibition of·OH,SOD and CAT activity in blood ofm ice(n=6)

與A組比較，a P<0.05；與B組比較，b P<0.05；與C組比較，c P<0.05

組別MDA/（nmol/mL）·OH/（U/mL）SOD/（U/L）CAT/（U/mL）A 組 2.31±0.41 358±72 232±55 26.3±3.9 B 組 15.62±3.68a 121±20a 128±26a 12.4±1.6a C 組 5.89±1.26b 283±49b 209±42b 22.6±2.8b D 組 15.89±3.85c 129±20c 128±28c 10.9±1.2c

2.3 A組肺組織 Nrf2為 0.20±0.04，B組為 0.38±0.08，C 為 0.60±0.16，D 組為 0.30±0.07。與 A 組比較，B組肺組織Nrf2表達增加（P<0.05）；與B組比較，C組肺組織Nrf2表達進一步增加（P<0.05）；與C組比較，D組肺組織Nrf2表達顯著降低（P<0.05），見圖1。

圖1 各組小鼠肺Nrf2表達的比較（n=6）Fig 1 Com parison of Nrf2 expression in lung ofm ice of different groups(n=6)

3 討論

CLP是膿毒癥實驗研究的經典動物模型[3-5]。本實驗采用此方法復制了重度膿毒癥小鼠模型，本課題組前期研究發現，CLP后1 h和6 h給予2%氫氣吸入，可以顯著改善小鼠SOD活性和生存率。

氫氣是易燃易爆的危險氣體，在空氣中安全濃度為<4.6%，>74.2%。在安全范圍內氫氣對多種疾病有治療作用，但是這種方法在日常生活中使用相當不便，也不適合長期預防和治療使用，所以Li等[4]通過使用富氫液觀察其對膿毒癥小鼠的影響，他們研究發現富氫液可以提高膿毒癥小鼠SOD、CAT活性和膿毒癥小鼠生存率，與2%氫氣治療膿毒癥具有同樣效果。故本實驗參考上述研究，選擇富氫液作為傳遞氫分子的方式，選擇CLP后1 h和6 h作為治療時間點。

膿毒癥在發展過程中，體內氧化物質大量堆積，抗氧化物質大量丟失，打破機體的氧化-還原系統平衡，導致病情進一步惡化，形成體內病理狀態惡性循環。MDA是多不飽和脂肪酸脂質過氧化的副產物，被用作氧化應激水平評估。·OH是活性最高、毒性最大的一種氧自由基，可以氧化核酸、蛋白質和脂質，同時發揮其生物毒性作用。SOD和CAT是清除氧自由基的主要酶類。本實驗結果表明，膿毒癥機體的氧化與抗氧化失衡中，SOD和CAT活性受到明顯抑制，機體抑制·OH能力顯著下降，而評價氧化損傷的MDA卻大量表達。

目前認為Keap1-Nrf2-ARE信號通路是生物體內最重要的內源性抗氧化系統，其中Nrf2是此系統的關鍵性分子。機體細胞受到有害刺激時，Nrf2激活后與核內ARE結合，誘導下游抗氧化蛋白（SOD、CAT、GSH-Px和NQO1等）和…相解毒酶（HO-1、Trx、Prx和GSTs）的表達，在防御保護中發揮重要作用。Thimmulappa等[6]發現Nrf2是先天性免疫反應關鍵性調節分子，Nrf2基因敲除可使膿毒癥動物器官損傷明顯加重，存活率明顯降低，而Nrf2高表達可使膿毒癥動物器官損傷減輕，存活率明顯提高。本實驗結果發現，富氫液可增加膿毒癥小鼠抑制·OH能力以及SOD、CAT活性表達和生存率，同時降低MDA表達。但是富氫液對D組膿毒癥小鼠抑制·OH能力以及SOD、CAT、MDA表達和生存率無明顯影響。本實驗研究結果提示，富氫液可能通過作用于Nrf2分子，促進其下游抗氧化酶的表達，降低氧自由基產生，從而逐漸恢復機體氧化-還原系統平衡，促進膿毒癥機體恢復，提高生存率。

綜上所述，富氫液是一種安全方便的氫氣使用方式，且對膿毒癥氧化損傷具有治療作用，其具體機制可能是通過激活內源性抗氧化系統Nrf2信號通路得以實現。

[1]Cheng B,Xie G,Yao S,etal.Epidemiology of severe sepsis in critically ill surgicalpatients in ten university hospitals in China[J].Crit CareMed,2007,35(11):2538

[2]Reid V L,Webster N R.Role ofmicroparticles in sepsis[J].Br J Anaesth,2012,109(4):503

[3]Xie K,Yu Y,Pei Y,etal.Protective effects of hydrogen gas on murine polymicrobial sepsis via reducing oxidative stress and HMGB1 release[J].Shock,2010,34:90

[4]LiGM,JiM H,Sun X J,etal.Effectsofhydrogen-rich saline treatmenton polymicrobialsepsis[J].JSurg Res,2013,181(2):279

[5]陳紅光,謝克亮,韓煥芝,等.氫氣對膿毒癥小鼠急性肺損傷的影響[J].中華麻醉學雜志,2012,32（2）:195

[6]ThimmulappaRK,Lee H,Rangasamy T,etal.Nrf2 isa critical regulator of the innate immune response and survival during experimentalsepsis[J].JClin Invest,2006,116(4):984

[7]Wang X J,Hayes JD,Henderson C J,etal.Identification of retinoic acid asan inhibitor of transcription factor Nrf2 through activation of retinoic acid receptoralpha[J].PNAS,2007(49):19589