抗糖尿病疫苗肽IA－2－P2對動脈粥樣硬化的影響

吳 潔，黃東成，申麗麗，翟婷婷，龍 軍，金 亮（.中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院微基因?qū)嶒炇遥暇?009；.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南京 003）

在科技高速發(fā)展的今天，心血管疾病仍是世界性的最主要致死疾病，全球每年約有1 670萬人死于心血管疾病。心血管疾病的主要病理機制是動脈粥樣硬化（AS），關(guān)于AS的發(fā)病機制曾有多種學(xué)說，目前普遍認為AS是一種慢性炎癥疾病［1］。在AS過程中免疫反應(yīng)貫穿始終，各種抗原、免疫細胞啟動血管壁的免疫反應(yīng)，最終誘發(fā)AS病變形成［2］，其中熱休克蛋白（hsp）及氧化低密度脂蛋白（oxLDL）被認為是AS中主要的自體抗原［3－4］。AS斑塊中包含了巨噬細胞、T細胞、其他免疫細胞及膽固醇等。AS斑塊不斷積累壯大，斑塊破裂時內(nèi)容物暴露，繼而血小板聚集，體液凝固從而引發(fā)血栓，形成多種心血管疾病，常見的如冠心病、高血壓、心率失常等。

IA－2－P2是我們基于人熱休克蛋白（hsp）60與胰島素瘤相關(guān)蛋白2（IA－2）開發(fā)的一種抗1型糖尿病（T1D）疫苗肽。基于人hsp60一段特異性片段P277開發(fā)的一種抗糖尿病疫苗肽DiaPeP277目前已進入Ⅲ期臨床，我們課題組前期研究證實，P277的后半段P2段為免疫預(yù)防T1D的關(guān)鍵表位［5］。另外IA－2為T1D中的一種自體胰島抗原，近年有報道發(fā)現(xiàn)IA－2的免疫療法對T1D有預(yù)防作用［6］。據(jù)此，我們用IA－2的兩段B表位替換P277原來的前半段，構(gòu)成新的抗T1D疫苗肽IA－2－P2，已證明該肽對NOD小鼠有預(yù)防T1D的作用。

HSP65／60分子屬于HSP60家族，相對分子質(zhì)量在60kDa左右，是生物體對外界刺激發(fā)生反應(yīng)而產(chǎn)生的應(yīng)激蛋白，進化上高度保守。自1992年起，人們已發(fā)現(xiàn)hsp60／65與 AS的高度相關(guān)性［7］；近年來許多研究表明，通過皮下免疫hsp60／65可促進AS的進程［8－9］，但也有研究發(fā)現(xiàn)，如果通過黏膜免疫hsp60／65會造成免疫耐受進而減輕模型動物AS程度［10－12］。我們課題組前期研究P277與AS的關(guān)系時發(fā)現(xiàn)，在高脂飼料喂養(yǎng)下以P277與弗氏不完全佐劑乳化后免疫可增加實驗兔AS斑塊面積，提示P277對AS可能存在的促進作用。因IA－2－P2的P2肽段來源于P277，本研究旨在考察在高脂飼料喂養(yǎng)下IA－2－P2與AS的關(guān)系。

1 儀器與材料

1.1 儀器 生化自動分析儀：Beckman Coulter Synchron DXC800。

1.2 材料 IA－2－P2多肽，氨基酸序列為“HGDTTFEYQDIPALDSLTPANED”，由上海吉爾公司通過自動化多肽合成儀合成，HPLC檢測質(zhì)量分數(shù)＞90%；10mmol·L－1鹽緩沖液（PBS）：8g NaCl，0.2g KCl，1.44g Na2HPO4，0.24g KH2PO4，加 水 至1 000mL；弗氏不完全佐劑（IFA）：購自Sigma公司。

1.3 動物 20只雄性新西蘭大白兔，實驗前平均體質(zhì)量約為2kg，購自江蘇省農(nóng)科院種兔場。隨機分為3組：低脂PBS組6只（PBS組），高脂PBS組6只（HCD 組），高 脂IA－2－P2組 8 只 （HCD＋IA－2－P2組）。保證飲水充足，低脂組以普通飼料喂養(yǎng)，高脂組以添加質(zhì)量分數(shù)0.5%膽固醇和質(zhì)量分數(shù)5%蛋黃粉的高脂飼料喂養(yǎng)［13］，持續(xù)17周。將PBS或是多肽溶液與IFA乳化，1mL乳化劑含0.5mL蛋白／PBS溶液（1mg·mL－1）和0.5mL IFA，每只兔給藥1mL，背部皮下6點免疫，第0周起免疫，間隔4周，共免疫4次。免疫前禁食12h，每只兔取2mL血液，分離得血清用于血脂檢測。

2 指標(biāo)檢測

2.1 血脂測定 使用生化自動分析儀測定血清總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）、三酰甘油（TG）。

2.2 主動脈斑塊分析 17周處死所有實驗兔，從主動脈弓至骼動脈處取下主動脈，縱向剪開。于福爾馬林中固定2d，以溶于體積分數(shù)75%乙醇中的2g·L－1蘇丹Ⅲ溶液染色20min，再以體積分數(shù)75%乙醇脫色［2］。拍照片后以MapInfo軟件計算斑塊百分比。

2.3 數(shù)據(jù)分析 所有實驗數(shù)據(jù)使用Student’s test檢驗統(tǒng)計學(xué)差異，判定P＜0.05為顯著性差異，P＜0.01為極顯著性差異。

3 結(jié)果

3.1 體質(zhì)量 第0，4和16周時各組實驗兔體質(zhì)量基本一致，各組間均無顯著性差異，提示高脂飼料喂養(yǎng)以及IA－2－P2免疫對兔體質(zhì)量都無明顯影響。

3.2 血脂

3.2.1 總膽固醇（TC）如圖1A所示，2個高脂組中TC值第4周起有顯著變化，均接近10mmol·L－1。至16周時，PBS組TC基本不變，HCD組TC值在16mmol·L－1左右，HCD＋IA－2－P2組血脂稍高（約達到19mmol·L－1），但高脂組間TC值無顯著性差異（P＞0.05），高脂組與低脂組間有極顯著性差異（P＜0.01）。

3.2.2 三酰甘油（TG）如圖1B，各組起始TG值基本一致；4周時各組TG值都稍微下降，但仍都在同一水平；16周低脂組TG仍不變而各高脂組TG均上升到2～3mmol·L－1，但各組間均無顯著性差異（P＞0.05）。可能是由于實驗兔TG值自身波動較大，高脂飼料喂養(yǎng)未能造成顯著性提升。

3.2.3 高密度脂蛋白（HDL）如圖1C，各組起始HDL基本一致；4周后低脂PBS對照組HDL無明顯變化，而各高脂組HDL都上升到了1.3mmol·L－1左右；16周低脂PBS對照組HDL仍不變，而各高脂組 HDL都升至2mmol·L－1以上，其中IA－2－P2組HDL稍高（接近3mmol·L－1），但經(jīng)計算各高脂組間無顯著性差異（P＞0.05），高脂組與低脂組間均有顯著性差異（P＜0.05）。

3.2.4 低密度脂蛋白（LDL）如圖1D，各組起始LDL基本一致；4周后低脂PBS對照組LDL無明顯變化，而各高脂組LDL都上升到了2mmol·L－1左右；16周時低脂組LDL不變，高脂組LDL達到4mmol·L－1以上，且高脂IA－2－P2組 LDL較其他高脂組偏高，但經(jīng)計算各高脂組間LDL均無顯著性差異（P＞0.05），高脂組與低脂PBS組間LDL有顯著性差異（P＜0.05）

圖1 抗糖尿病疫苗肽IA－2－P2對血脂水平的影響A.總膽固醇；B.三酰甘油；C.高密度脂蛋白；D.低密度脂蛋白注：與PBS組相比＊P＜0.05，＊＊P＜0.01Fig.1 Effects of anti－diabetic peptide vaccine IA－2－P2on blood lipid levelsA.total cholesterol（TC）；B.triglyceride（TG）；C.high density lipoprotein（HDL）；D.low density lipoprotein（LDL）Note：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs the PBS group

3.3 主動脈斑塊面積分析 如圖2所示，經(jīng)MapInfo軟件計算，PBS低脂組基本無斑塊，高脂PBS組斑塊比例約為18%，而高脂IA－2－P2組斑塊比例約為28%，與高脂PBS組相比，P＞0.05，無顯著性差異。顯示在高脂喂養(yǎng)條件下IA－2－P2對AS可能有輕度促進作用。

4 討論

本研究首次闡明了在高脂飼料喂養(yǎng)下P277類似肽IA－2－P2免疫對AS模型兔的影響。本實驗結(jié)果顯示，IA－2－P2免疫對模型兔的體質(zhì)量增加無明顯影響，提示IA－2－P2對兔的食欲與生長無影響；與高脂對照組相比，IA－2－P2對血脂水平無明顯影響，包括TC、TG、HDL、LDL；而最終斑塊統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)相較于高脂對照組（18%），IA－2－P2形成面積更大的斑塊（28%），但數(shù)據(jù)分析二者P＞0.05。高血脂導(dǎo)致AS斑塊形成，而IA－2－P2的免疫在高脂飲食的情況下對AS斑塊的形成有輕度促進作用，但對正常飲食的家兔AS斑塊的形成是否有促進作用，相關(guān)實驗正在進行中。我們在前期的實驗中發(fā)現(xiàn)，高脂飼料喂養(yǎng)下，P277免疫也可加重實驗兔AS斑塊生成，而在普通飼料喂養(yǎng)下對實驗兔AS斑塊形成卻沒有影響（數(shù)據(jù)正在整理中）。

Hsp60不單是T1D中的自身抗原，研究表明Hsp60／65與多種自身免疫疾病相關(guān)，包括T1D、關(guān)節(jié)炎、多 發(fā) 性 硬 化、動 脈 粥 樣 硬 化 等［14－15］。 由 于Hsp60／65較高的同源性，可能發(fā)生交叉免疫反應(yīng)。人體正常情況下存在抗hsp60免疫力，人血管內(nèi)皮細胞不在胞外表達hsp60，但在經(jīng)典AS風(fēng)險因子壓力下，內(nèi)皮細胞會同步表達黏附分子與hsp60，繼而已有的抗微生物hsp60免疫力會對目標(biāo)分子殺傷，從而促進AS進程。高脂飲食作為經(jīng)典AS風(fēng)險因子之一，可引起內(nèi)皮細胞表達hsp60，導(dǎo)致機體本身對hsp60分子的細胞、體液免疫產(chǎn)生應(yīng)答，損毀靶細胞，引起單核細胞內(nèi)膜浸潤，從而促進炎癥發(fā)生［16］。

Perschinka等報道，認為hsp60上位于437～452肽段的B表位與hsp65相應(yīng)表位存在交叉免疫［17］，Uray等的結(jié)果也與之相符［18］。IA－2－P2包含hsp60的部分B表位（448～452），并含有與自身免疫糖尿病相關(guān)的關(guān)鍵T表位，免疫后可引發(fā)機體產(chǎn)生細胞免疫。以佐劑混合后免疫IA－2－P2，同時激發(fā)體液免疫和細胞免疫，可能造成機體上調(diào)對hsp60的免疫力，對目標(biāo)內(nèi)皮細胞上表達的hsp60分子進行免疫，從而加劇斑塊處炎癥，繼而促進AS斑塊產(chǎn)生，但由我們所獲數(shù)據(jù)顯示這一促進作用是十分有限的。

本研究表明，在高脂飼料喂養(yǎng)條件下，與模型組相比免疫IA－2－P2后，實驗兔體質(zhì)量及血脂水平無明顯改變，但在一定程度上會促進AS斑塊的形成，具體機制還有待進一步研究。

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