氯霉素水楊酸搽劑微生物限度檢查方法的驗證

天津市水閣醫(yī)院（300100）鄧菲 宋瑩

氯霉素水楊酸搽劑是氯霉素、水楊酸等組成的外用化藥制劑，有止癢、殺菌、溶解脂肪酸的作用，用于治療痤瘡、酒糟鼻、脂溢性伴毛囊炎型皮炎。根據(jù)《中國藥典》2010年版的規(guī)定，藥品在進行微生物限度檢查前必須對其檢查方法進行驗證，以確認該供試品所采用的檢查方法無抑菌作用后在進行檢查，才能真實反映該藥品受污染的程度[1]。結(jié)果證實氯霉素水楊酸搽劑的細菌、霉菌、酵母菌和控制菌檢查均采用常規(guī)法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LIBRORAEG120電子天平（川本島津）；YJA電動勻漿儀（臺州市椒江五星機械儀器有限公司）；MJX-1501培養(yǎng)箱（廣東省醫(yī)療器械廠）。

1.2 試藥與培養(yǎng)基 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（批號080919），玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基（批號080606），膽鹽乳糖培養(yǎng)基（批號080528），營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（批號070111），pH7.0的無菌氫氧化鈉-蛋白胨緩沖液（批號070413），改良馬丁培養(yǎng)基（批號080408）均為中國藥品生物制品檢定所提供；氯霉素水楊酸搽劑（批號20120815，20120816，20120817）。

1.3 菌種 大腸埃希菌[CMCC(B)44102]；金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]；枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]；白色念珠菌[CMCC(F)98001]；黑曲霉[CMCC(F)98003]；銅綠假單孢菌[CMCC(B)10104]，均由中國藥品生物制品檢定所提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液制備 取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，34℃培養(yǎng)18～24h；取白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物接種至改良馬丁培養(yǎng)基中，26℃培養(yǎng)24～48h。上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)約為50～100cfu的菌懸液。取黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物接種至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中，經(jīng)26℃培養(yǎng)5～7d后，加入3～5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將霉菌孢子洗脫。然后吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)為50～100cfu的菌懸液。

2.2 供試液的制備 取本品10ml，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，振搖均勻，制成1∶10的供試液。

2.3 方法驗證

2.3.1 細菌、霉菌和酵母菌計數(shù)的驗證

2.3.1.1 細菌計數(shù)的驗證

2.3.1.1.1 試驗組 取本品1ml過膜，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液300ml分次沖洗，并在最后一次的沖洗液中加入規(guī)定量試驗菌（50～100cfu），取濾膜貼于相應(yīng)的培養(yǎng)基上。

2.3.1.1.2 菌液組 取1ml試驗菌（約50～100cfu），分別注入平皿中，立即傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，測定所加菌數(shù)。

2.3.1.1.3 供試品對照組 取供試液1ml，按菌落計數(shù)方法測定供試品本底細菌數(shù)。

2.3.1.1.4 稀釋劑對照組 取規(guī)定量試驗菌，同供試品處理后，取1ml（含試驗菌約50～100cfu）薄膜過濾，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液300ml分數(shù)次沖洗后，取濾膜貼于相應(yīng)的培養(yǎng)基上。

2.3.1.2 霉菌和酵母菌計數(shù)的驗證

2.3.1.2.1 試驗組 取本品10ml，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，振搖均勻，制成1∶10的供試液。取1∶10供試液1ml和規(guī)定量試驗菌（約50～100cfu），分別注入平皿中，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備兩個平皿。

2.3.1.2.2 菌液組 取1ml試驗菌（約50～100cfu），分別注入平皿中，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，測定所加菌數(shù)。

2.3.1.2.3 供試品對照組 取供試液1ml，按菌落計數(shù)方法測定供試品本底菌數(shù)。

試驗組菌回收率＝（試驗組菌落數(shù)-供試品對照組菌落數(shù)）/試驗組菌落數(shù)×100%。

稀釋劑對照組回收率＝稀釋劑對照組菌落數(shù)/試驗組菌落數(shù)×100%。

《中國藥典》規(guī)定對各試驗菌株的回收率均不得低于70%。測定該品種對5個試驗菌株的回收率，以確定其抑菌程度。由附表1可知本品對大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌和黑曲霉有抑菌作用。結(jié)果見附表1。

附表1 各試驗菌株的回收率（%）

2.3.2 控制菌檢查法的驗證

2.3.2.1 金黃色葡萄球菌檢查法的驗證

2.3.2.1.1 試驗組 取本品1ml過膜，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液300ml分次沖洗，并在最后一次沖洗液中加入規(guī)定量的金黃色葡萄球菌（約10～100cfu），取濾膜加入到100ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24～48h。

2.3.2.1.2 陽性對照組 取規(guī)定量金黃色葡萄球菌（約10～100cfu），加入到100ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24～48h。取試驗組、陽性對照組上述培養(yǎng)物，劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)24～72h，平板上均呈現(xiàn)典型菌落。

2.3.2.1.3 實驗結(jié)果 陽性對照組檢出金黃色葡萄球菌，試驗組檢出金黃色葡萄球菌；驗證結(jié)果符合要求。

2.3.2.2 銅綠假單孢菌檢查法的驗證

2.3.2.2.1 試驗組 取本品1ml過膜，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液300ml分次沖洗，并在最后一次沖洗液中加入規(guī)定量的銅綠假單孢菌（約10～100cfu），取濾膜加入到100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，依法檢查。

2.3.2.2.2 陽性對照菌 取規(guī)定量銅綠假單孢菌（約10～100cfu），加入到100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18～24h。取試驗組、陽性對照組上述培養(yǎng)物，劃線接種于溴化十六烷三甲胺瓊脂培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)18～24h，平板上均呈現(xiàn)典型菌落。

2.3.2.2.3 實驗結(jié)果 陽性對照組檢出銅綠假單孢菌，試驗組檢出銅綠假單孢菌；驗證結(jié)果符合要求。

2.3.2.3 供試品控制菌檢查

2.3.2.3.1 金黃色葡萄球菌 取本品1ml過膜，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液300ml分次沖洗，取濾膜加入到100ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，依法檢查，結(jié)果每1ml樣品中未檢出金黃色葡萄球菌。

2.3.2.3.2 銅綠假單孢菌 取本品1ml過膜，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液300ml分次沖洗，取濾膜加入到100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，依法檢查，結(jié)果每1ml樣品中未檢出銅綠假單孢菌。

2.4 按驗證合格的方法進行本品微生物限度檢查，結(jié)果見附表2。

附表2 氯霉素水楊酸搽劑微生物限度檢查結(jié)果

3 討論

制劑的微生物限度檢查通常是按常規(guī)的藥品衛(wèi)生學檢驗方法進行細菌、霉菌和酵母菌計數(shù)的。由于本品是含有多種成分的化學藥制劑，其中任何具有抑菌作用的成分均可影響微生物限度檢查的準確性。為此，本實驗以5種陽性對照菌的回收率作為評價指標，確定了氯霉素水楊酸搽劑的微生物限度檢查方法。該方法可用于氯霉素水楊酸搽劑微生物的質(zhì)量控制。