氯霉素水楊酸搽劑微生物限度檢查方法的驗證

天津市水閣醫院（300100）鄧菲 宋瑩

氯霉素水楊酸搽劑是氯霉素、水楊酸等組成的外用化藥制劑，有止癢、殺菌、溶解脂肪酸的作用，用于治療痤瘡、酒糟鼻、脂溢性伴毛囊炎型皮炎。根據《中國藥典》2010年版的規定，藥品在進行微生物限度檢查前必須對其檢查方法進行驗證，以確認該供試品所采用的檢查方法無抑菌作用后在進行檢查，才能真實反映該藥品受污染的程度[1]。結果證實氯霉素水楊酸搽劑的細菌、霉菌、酵母菌和控制菌檢查均采用常規法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LIBRORAEG120電子天平（川本島津）；YJA電動勻漿儀（臺州市椒江五星機械儀器有限公司）；MJX-1501培養箱（廣東省醫療器械廠）。

1.2 試藥與培養基 營養瓊脂培養基（批號080919），玫瑰紅鈉瓊脂培養基（批號080606），膽鹽乳糖培養基（批號080528），營養肉湯培養基（批號070111），pH7.0的無菌氫氧化鈉-蛋白胨緩沖液（批號070413），改良馬丁培養基（批號080408）均為中國藥品生物制品檢定所提供；氯霉素水楊酸搽劑（批號20120815，20120816，20120817）。

1.3 菌種 大腸埃希菌[CMCC(B)44102]；金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]；枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]；白色念珠菌[CMCC(F)98001]；黑曲霉[CMCC(F)98003]；銅綠假單孢菌[CMCC(B)10104]，均由中國藥品生物制品檢定所提供。

2 方法與結果

2.1 菌液制備 取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養物接種至營養肉湯培養基中，34℃培養18～24h；取白色念珠菌的新鮮培養物接種至改良馬丁培養基中，26℃培養24～48h。上述培養物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數約為50～100cfu的菌懸液。取黑曲霉的新鮮培養物接種至改良馬丁瓊脂斜面培養基中，經26℃培養5～7d后，加入3～5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將霉菌孢子洗脫。然后吸出孢子懸液至無菌試管內，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數為50～100cfu的菌懸液。

2.2 供試液的制備 取本品10ml，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，振搖均勻，制成1∶10的供試液。

2.3 方法驗證

2.3.1 細菌、霉菌和酵母菌計數的驗證

2.3.1.1 細菌計數的驗證

2.3.1.1.1 試驗組 取本品1ml過膜，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液300ml分次沖洗，并在最后一次的沖洗液中加入規定量試驗菌（50～100cfu），取濾膜貼于相應的培養基上。

2.3.1.1.2 菌液組 取1ml試驗菌（約50～100cfu），分別注入平皿中，立即傾注營養瓊脂培養基，測定所加菌數。

2.3.1.1.3 供試品對照組 取供試液1ml，按菌落計數方法測定供試品本底細菌數。

2.3.1.1.4 稀釋劑對照組 取規定量試驗菌，同供試品處理后，取1ml（含試驗菌約50～100cfu）薄膜過濾，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液300ml分數次沖洗后，取濾膜貼于相應的培養基上。

2.3.1.2 霉菌和酵母菌計數的驗證

2.3.1.2.1 試驗組 取本品10ml，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，振搖均勻，制成1∶10的供試液。取1∶10供試液1ml和規定量試驗菌（約50～100cfu），分別注入平皿中，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養基，每株試驗菌平行制備兩個平皿。

2.3.1.2.2 菌液組 取1ml試驗菌（約50～100cfu），分別注入平皿中，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養基，測定所加菌數。

2.3.1.2.3 供試品對照組 取供試液1ml，按菌落計數方法測定供試品本底菌數。

試驗組菌回收率＝（試驗組菌落數-供試品對照組菌落數）/試驗組菌落數×100%。

稀釋劑對照組回收率＝稀釋劑對照組菌落數/試驗組菌落數×100%。

《中國藥典》規定對各試驗菌株的回收率均不得低于70%。測定該品種對5個試驗菌株的回收率，以確定其抑菌程度。由附表1可知本品對大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌和黑曲霉有抑菌作用。結果見附表1。

附表1 各試驗菌株的回收率（%）

2.3.2 控制菌檢查法的驗證

2.3.2.1 金黃色葡萄球菌檢查法的驗證

2.3.2.1.1 試驗組 取本品1ml過膜，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液300ml分次沖洗，并在最后一次沖洗液中加入規定量的金黃色葡萄球菌（約10～100cfu），取濾膜加入到100ml營養肉湯培養基中，培養24～48h。

2.3.2.1.2 陽性對照組 取規定量金黃色葡萄球菌（約10～100cfu），加入到100ml營養肉湯培養基中，培養24～48h。取試驗組、陽性對照組上述培養物，劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養基平板上，培養24～72h，平板上均呈現典型菌落。

2.3.2.1.3 實驗結果 陽性對照組檢出金黃色葡萄球菌，試驗組檢出金黃色葡萄球菌；驗證結果符合要求。

2.3.2.2 銅綠假單孢菌檢查法的驗證

2.3.2.2.1 試驗組 取本品1ml過膜，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液300ml分次沖洗，并在最后一次沖洗液中加入規定量的銅綠假單孢菌（約10～100cfu），取濾膜加入到100ml膽鹽乳糖培養基中，依法檢查。

2.3.2.2.2 陽性對照菌 取規定量銅綠假單孢菌（約10～100cfu），加入到100ml膽鹽乳糖培養基中，培養18～24h。取試驗組、陽性對照組上述培養物，劃線接種于溴化十六烷三甲胺瓊脂培養基平板上，培養18～24h，平板上均呈現典型菌落。

2.3.2.2.3 實驗結果 陽性對照組檢出銅綠假單孢菌，試驗組檢出銅綠假單孢菌；驗證結果符合要求。

2.3.2.3 供試品控制菌檢查

2.3.2.3.1 金黃色葡萄球菌 取本品1ml過膜，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液300ml分次沖洗，取濾膜加入到100ml營養肉湯培養基中，依法檢查，結果每1ml樣品中未檢出金黃色葡萄球菌。

2.3.2.3.2 銅綠假單孢菌 取本品1ml過膜，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液300ml分次沖洗，取濾膜加入到100ml膽鹽乳糖培養基中，依法檢查，結果每1ml樣品中未檢出銅綠假單孢菌。

2.4 按驗證合格的方法進行本品微生物限度檢查，結果見附表2。

附表2 氯霉素水楊酸搽劑微生物限度檢查結果

3 討論

制劑的微生物限度檢查通常是按常規的藥品衛生學檢驗方法進行細菌、霉菌和酵母菌計數的。由于本品是含有多種成分的化學藥制劑，其中任何具有抑菌作用的成分均可影響微生物限度檢查的準確性。為此，本實驗以5種陽性對照菌的回收率作為評價指標，確定了氯霉素水楊酸搽劑的微生物限度檢查方法。該方法可用于氯霉素水楊酸搽劑微生物的質量控制。