光果翠雀止血作用機制研究及安全性評價＊

費改順，賈正平，盛 杰

(中國人民解放軍蘭州軍區蘭州總醫院，甘肅 蘭州 730050)

光果翠雀 Delphinium grandiflorum L．var．leiocarpum W．T．Wang 為毛茛科翠雀屬植物，分布于山西(靈石)、寧夏、甘肅東部(涇川、正寧)、陜西(中部以北)等地，生長于海拔680～1 800 m的山坡、草地、固定沙丘等背陰處[1]。該植物在民間用于治療風熱牙痛、疥癬、頭虱及跌打損傷、止血止痛，具有獨特作用。光果翠雀根于農歷6月初采集后，除去地上部分和須根，洗凈泥土，曬干，粉碎后于密閉容器保存備用。前期研究表明[2－3]，光果翠雀含有多種生物堿，主要有二萜生物堿類化合物如牛扁堿(lyconctonine)、甲基牛扁堿(methyllycoctonine)、德爾色明甲(delsemine A)、德拉瓦印(delavaine)，黃酮類化合物如槲皮素(quercitin)、山柰酚(kaempferol)、異鼠李素(isorhamnetin)，甾體類化合物如β－谷甾醇、胡蘿卜苷、脂肪酸類化合物等;光果翠雀根的原粉及其水提物、醇提物具有良好的止血鎮痛作用。光果翠雀盡管作為草藥在民間應用，但關于其止血作用的機理及安全性目前卻未見任何文獻報道。本研究中采用小鼠斷尾法考察光果翠雀對出凝血時間的影響，探究其止血作用的機制，并通過毒性研究為其安全使用使用提供一定的參考。

1 材料與方法

1．1 材料

Wistar大鼠，雄性，體重180～200 g，由甘肅腫瘤研究所提供;新西蘭大白兔，體重(2．5±0．2)kg，由蘭州生物制品研究所提供，本院動物實驗科適應性飼養5 d;BalB/C小鼠，體重(20±2)g，由蘭州軍區總醫院動物實驗科提供。光果翠雀于2006年6月采自陜西靖邊縣，經蘭州大學趙汝能教授鑒定為毛茛科翠雀屬植物光果翠雀 Delphinium grandiflorum L．var．leiocarpum W．T．Wang。其根曬干后粉碎過100目篩，為白色粉性粉末，味苦、氣微，具有較強的吸濕性，故密閉保存。云南白藥(批號為20030803);創愈散粉(批號為20031102);凝血酶原時間(PT)、凝血酶時間(TT)、部分凝血活酶活性時間(APTT)、纖維蛋白原(FIB)檢測試劑盒由美國 Istrumentation Laboratory生產，實驗儀器為美國 Beckman Coulter產ACL9000型全自動凝血/纖溶分析儀。

1．2 方法

口服給藥對大鼠凝血功能指標的影響:取Wistar大鼠，隨機分成5組，即空白對照組(A組)、云南白藥組(B組，0．9 g/kg)、創愈散高劑量組(C1組，0．9 g/kg)、創愈散中劑量組(C2組，0．45 g/kg)、創愈散低劑量組(C3組，0．23 g/kg)，每組10只，連續灌胃給藥7 d，A組給予同樣體積的生理鹽水。末次給藥后1 h，3%戊巴比妥0．5 mL腹腔注射麻醉，頸總動脈取血1．7 mL，加于含枸櫞酸鈉抗凝劑0．3 mL的采血管中。搖勻，3 000 r/min，離心3 min，取血清 400 μL，測定 PT，APTT，TT 及 FIB 含量。

外用于破損皮膚對大白兔各系統的影響:取新西蘭大白兔6 只，體重(2．6 ±0．2)kg，背部兩側去毛，面積約 150 cm2。隨機分為兩組，參照2009年中華人民共和國衛生部藥政管理局《中藥新藥研究指南(藥學藥理學、毒理學)》低劑量組給藥1．5 g，高劑量組給藥4．5 g。用砂紙打磨至滲血，造成皮膚破損，將翠雀根粉以適量蒸餾水調成糊狀，涂于破損皮膚表面，紗布覆蓋包扎，24 h后洗凈藥物，觀察去除受試藥物后1，24，48，72 h時至9 d的體重，以及中樞和運動神經系統、植物神經系統、呼吸系統、心血管系統、胃腸系統、泌尿生殖系統和皮膚、皮毛眼等各系統或部位的中毒表現。

外用皮膚刺激性試驗:參照文獻[4]，采用半封閉斑貼法。取新西蘭大白兔4只，體重(2．6±2)kg，先剪去背毛，再用適量8%Na2S脫毛。將翠雀根粉0．5 g調成糊狀，覆蓋約直徑1 cm的皮膚，以紗布作為斑貼覆蓋物，膠布固定，4 h后去掉斑貼，清洗皮膚，觀察 0．5，1，24，48，72 h 的皮膚反應(紅斑及水腫)。

小鼠口服毒性試驗:試驗藥光果翠雀根粉，按用量稱取，用蒸餾水配制，小鼠灌胃給藥給藥，每10 g體重給藥0．1 mL，以不等質量濃度等容量給藥。

1．3 統計學處理

2 結果

2．1 口服給藥對大鼠凝血功能指標的影響

結果見表1。可見，光果翠雀能明顯縮短PT和APTT，而對TT和FIB無明顯影響，高劑量光果翠雀縮短PT及APTT的作用更顯著。

表1 光果翠雀口服對大鼠凝血功能指標的影響()

表1 光果翠雀口服對大鼠凝血功能指標的影響()

注:與 A 組比較，Dunnett t檢驗，＊P ＜0．05。

組別A組B組C1組C2組C3組給藥及劑量生理鹽水云南白藥0．9 g/kg光果翠雀0．9 g/kg光果翠雀0．45 g/kg光果翠雀0．23 g/kg n 9 1 0 10 10 9 PT(s)20．11 ± 4．15 17．87±1．27＊18．00±1．99＊18．34 ± 0．95 17．46 ± 1．15＊APTT(s)26．64 ± 5．84 23．63 ±4．25＊21．97 ±4．65＊24．04 ± 1．24 22．22 ± 2．19 TT(s)21．73 ± 2．9 20．88 ±2．98 20．43 ±3．24 20．17 ± 1．78 20．97 ± 4．70 FIB(μg/mL)1．81 ± 0．21 2．29 ±0．34 2．24 ±0．34 2．17 ± 0．82 2．00 ± 0．64

2．2 外用于破損皮膚對大白兔各系統的影響

破損皮膚外用光果翠雀后，大白兔行為正常，無躁動不安或靜伏少動現象，無抽搐、震顫、麻醉、局部肌肉抽動、煩燥易怒、冷漠、感覺過敏現象。結果表明，破損皮膚外用光果翠雀對大白兔中樞和運動系統、神經系統、植物神經系統、呼吸系統、心血管系統、胃腸系統、泌尿生殖系統和皮膚、皮毛等均無明顯毒性作用。

2．3 外用皮膚刺激性試驗

經過72 h的試驗，大白兔斑貼處皮膚未見任何紅斑和水腫。結果表明，光果翠雀外用無明顯皮膚刺激作用。

2．4 口服急性毒性試驗

預試驗結果表明，小鼠口服每kg體重25，20，10 g藥物時，動物100%死亡;而口服每kg體重8，5，2，1 g藥物時動物死亡率分別為 70%，60%，0，0。

根據預試驗結果，在10 g/kg和5 g/kg之間以0．7為組間距，設 10．0，7．0，4．9，3．4，2．4 g/kg，5 個劑量組，每組 10 只動物，雌雄各半，進行急性毒性試驗。觀察到，動物死亡時間一般在10 min以內，死亡前先出現眼球突出，繼而步態不穩，口唇、四肢青紫、發紺，死亡后不易僵尸;解剖發現肺輕度充血，其他臟器未明顯異常。用Bliss法[5]計算，光果翠雀根粉小鼠灌胃的半數致死量(LD50)為 4．3 g/kg。

為進一步研究毒性成分的部位，對其水溶性部分、脂溶性部分、醇溶性部分及生物堿部分的毒性也進行了研究。結果表明，其主要毒性部分是生物堿，小鼠灌胃給藥的 LD50為0．045 g/kg;水溶性部分的毒性較小，給藥量達5 g/kg時無動物死亡;脂溶性部分、醇溶性部分的毒性介于前兩者之間。

3 討論

長期以來，光果翠雀在民間作為跌打損傷、止血鎮痛草藥應用，但對其作用機制尚未見研究報道。本研究中闡明了光果翠雀止血的藥理學基礎是通過縮短PT和APTT來實現的。化學成分研究發現[2]，光果翠雀含淀粉量比較高，密度小，創傷外用易于鋪展在出血傷口表面，止血作用良好，優于云南白藥。破損皮膚刺激試驗和毒性試驗結果表明，光果翠雀外用安全，無皮膚刺激作用和明顯的毒性反應。

小鼠灌胃的急性毒性作用研究顯示，光果翠雀中毒潛伏期小于10 min，小鼠灌胃 LD50小于5 g/kg，中毒癥狀十分嚴重，重要臟器(肺)有損害，屬于中藥中有大毒者[5]。因此，民間口服應用時必須嚴格掌握劑量，否則容易引起中毒。另外還觀察到，光果翠雀口服毒性大，而皮損皮膚為何未見明顯毒性反應，可能是本研究中動物皮膚破損程度小，藥物外用劑量小，故通過皮膚吸收的量不足以引起嚴重的毒性反應。如何使其毒性降低，而保留其良好的止血鎮痛等藥理作用，以及外用時為何毒性小等問題，值得進一步研究。8994670(電子信箱)gaishunfei@sina．com．cn。

[1]中國科學院植物研究所，中國醫學科學院藥物研究所．中國植物志(第 27卷)[M]．北京:科學出版社，1979:446 －447．

[2]楊雪華．光果翠雀的化學成分研究[D]．蘭州:蘭州大學，2008．

[3]費改順，賈正平，喬樹洲，等．光果翠雀的止血鎮痛作用[J]．中國醫院藥學雜志，2010，30(11):898－900．

[4]王治喬，袁伯俊．新藥臨床前安全性評價與實踐[M]．北京:軍事醫學科學出版社，1997:24，153－154．

[5]李儀奎．中藥藥理實驗方法學[M]．上海:上海科技出版社，1996:1 003－1 004．