水蛭提取液對體外培養 RF/6A的細胞液中MMP-2、IV型膠原含量的影響△

鄭燕林 劉聰慧 沙菽

基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases MMPs)是一個Zn+依賴性蛋白酶家族，產生于正常組織細胞(包括結締組織細胞、內皮細胞、胸腺細胞、巨噬細胞和淋巴細胞等)和腫瘤細胞，以前酶形式分泌，于細胞外間隙激活后發揮作用。

研究已發現MMPs與血管新生［1-3］、腫瘤細胞的侵襲及轉移以及細胞外基質(extracellular matrix，ECM)的降解過程密切相關，是降解ECM的主要成份［4-7］。前期研究發現64 g·L－1水蛭提取液對體外培養的視網膜血管內皮細胞有抑制增殖作用［8］，為進一步證明水蛭提取液對內皮細胞微環境的作用，本實驗擬采用酶聯免疫法(enzyme linked immunosorbent，ELISA)、放射免疫法檢測水蛭提取液對細胞培養上清液中 MMP-2、IV型膠原(IV型膠原)表達的影響，初探水蛭提取液對新生血管生長的作用機制。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 中藥水蛭提取液購自成都中醫藥大學附屬醫院制劑科(批號:2007030201)，RF/6A(上海中科院細胞庫)，體積分數為10%的特級胎牛血清(北京元亨公司)，1640干粉(GIBCO公司)，25 g·L－1胰蛋白酶(美國 Sigma公司)，MCD-15A 型二氧化碳培養箱(日本SANYO公司)，JJT-900/1300型超凈工作臺(北京半導體設備廠)，XDS-1型倒置相差顯微鏡(重慶光學儀器廠)，IV型膠原放射免疫試劑盒(北京北方生物技術研究所)，MMP-2 ELISA試劑盒(上海森雄公司)，GC-1200放射免疫技術器(中國科大創新股份有限公司)，550酶標儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 水蛭提取液的制備 取水蛭粗粉31.5 g，加體積分數75%乙醇200 mL，使均勻潤濕，加蓋，放置2 h，裝入滲濾筒中。添加體積分數75%乙醇高出藥面3 cm，排除筒內空氣。加蓋放置48 h后放出藥液，流速3 mL·min－1，并從藥面不斷添加體積分數75%乙醇5000 mL，滲濾液回收乙醇至無醇味，定容至50 mL，每毫升相當于0.63 g原生藥，藥液經60℃照射滅菌，備用。……