黃芪對大鼠腎臟缺血再灌注損傷的保護作用及其對細胞凋亡影響的研究

郭保偉 付剛 劉艷梅 邱道顯 馬志鵬

細胞凋亡在臨床上十分常見, 譬如器官移植排斥反應(yīng)及器官缺血再灌注損傷都存在細胞凋亡。黃芪對心、腦缺血再灌注損傷具有一定保護作用, 但對腎缺血再灌注損傷是否具有保護作用及其凋亡影響的研究報道較少。本研究目的是觀察黃芪注射液對腎臟缺血再灌注損傷的保護作用及其對細胞凋亡影響, 探討其可能機制, 為臨床應(yīng)用黃芪防治腎臟缺血再灌注損傷提供實驗依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 健康清潔級SD大鼠30只, 體質(zhì)量(240±10)g,購自青島市動物實驗中心。

1.2 藥品與試劑 尿素氮、肌酐、丙二醛、超氧化物歧化酶試劑盒均購自上海生物研究所, 黃芪注射液由成都地奧九泓制藥廠生產(chǎn), 原位細胞凋亡(TUNEL)試劑盒、SP二抗免疫組化試劑盒購自武漢博士得生物工程有限公司。

1.3 方法 模型制備將SD大鼠術(shù)前飼養(yǎng)1周, 手術(shù)前禁食6 h, 將實驗動物隨機分為三組(n=10), A組為缺血再灌注組,B組為黃芪治療組, C 組為正常對照組。A組從門靜脈注入NS1.2 ml/100 g, 10 min后夾閉腎動脈, 當阻斷45 min后去除腎動脈夾再灌注, 肉眼觀察腎臟由暗紅色變?yōu)轷r紅色, 說明腎臟再灌注成功, 縫合切口, 24 h后采血；B組用黃芪針劑1.2 ml/100 g代替NS, 其余處理同再灌注組；C組從門靜脈注入NS 1.2 ml/100 g, 但不夾閉腎動脈, 等暴露45 min后縫合切口。切口縫合后繼續(xù)喂養(yǎng)24 h, 自由攝水, 進食。24 h后麻醉取血液標本, 行有關(guān)酶學(xué)和生化指標檢測。切除大鼠腎臟, 用4%低聚甲醛溶液固定, 石蠟包埋并編號, 待做病理學(xué)檢查。

1.4 檢測指標及方法

1.4.1 血清BUN、Cr、SOD、MDA測定 采集各組的血液標本, 用生化分析儀測定各組血肌肝、尿素氮含量。血漿中的SOD測定用黃嘌呤氧化酶法, 血漿中的MDA測定用試劑盒說明書操作。

1.4.2 腎組織切片制備 將用4%低聚甲醛溶液固定, 石蠟包埋并編號的標本, 4 μm厚連續(xù)切片, 行HE染色觀察。

1.4.3 凋亡指數(shù)的檢測 利用TUNEL法檢測細胞凋亡指數(shù), 凋亡細胞鏡下胞體縮小, 核膜皺縮, 染色不均勻, 細胞核中有棕黃色顆粒, 可見核固縮及核碎裂。每張切片在400倍鏡下觀察10個連續(xù)不重疊視野, 計數(shù)凋亡細胞數(shù)和細胞總數(shù), 凋亡指數(shù)=(凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù))×100%。

1.4.4 Bcl-2蛋白表達 用免疫組化SABC法測定Bcl-2蛋白表達。Bcl-2陽性表達為胞漿染色呈棕黃色, 而Bax蛋白陽性表達表現(xiàn)為胞漿染色黃褐色, 每張切片在400倍鏡下觀察10個連續(xù)不重疊視野, 后用HPIAS-1000高清晰彩色病理圖像免疫組化軟件分析其平均灰度值, 可視為Bcl-2或Bax的相對含量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS18.0軟件統(tǒng)計數(shù)據(jù)。計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示, 采用t檢驗, 計數(shù)資料采用χ2分析, P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血BUN、Cr、SOD、MDA的測定結(jié)果 A組與C組比較, 前者術(shù)后BUN、Cr水平明顯高于后者, 二者比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), B組與A組比較, 后者較前者術(shù)后BUN、Cr水平顯著下降, 二者比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。A組和B組血漿SOD均顯著低于C組(P<0.05), 而MDA水平顯著高于C組(P<0.05), B組血漿SOD顯著高于A組(P<0.05), 而MDA顯著性低于A組(P<0.05), 具體見表1。

2.2 腎臟組織病理 ①光鏡下病理變化：正常對照組腎小管結(jié)構(gòu)基本正常, 腎小管上皮細胞無變性壞死, 腔內(nèi)未發(fā)現(xiàn)管型。黃芪治療組腎小管上皮細胞腫脹明顯, 空泡可見變性,腎小管上皮細胞局部見到壞死脫落, 間質(zhì)可見出血。缺血再灌注組腎皮質(zhì)腎小管壞死廣泛, 腎間質(zhì)局部出血、水腫, 并見蛋白管型, 可見到腎小管輪廓, 腎小球結(jié)構(gòu)基本完整。比較而言, 黃芪治療組與缺血再灌注組比較, 病理改變明顯減輕。②腎小管細胞凋亡指數(shù)變化：在光學(xué)顯微鏡下, 凋亡細胞的胞核中有棕黃色顆粒, 可見核固縮及核碎裂。以遠端腎小管上皮細胞多見, 近曲腎小管上皮細胞和間質(zhì)少見, 腎小球未見到凋亡細胞。治療組凋亡指數(shù)明顯低于缺血再灌注組(P<0.05)。③Bcl-2及Bax蛋白表達情況：結(jié)果表明Bcl-2及Bax蛋白表達以腎小管上皮細胞為主, A組與C組比較, Bax表達顯著增強, 二者比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01), 而Bcl-2表達略增強(P<0.05), Bcl-2/ Bax比值明顯下降, 二者比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；B組與A組比較, Bax表達下降明顯, 二者比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), Bcl-2表達明顯增強, 二者比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01), Bcl-2/Bax比值升高, 二者比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01), AI顯著低于A組(P<0.05)。具體見表2。

表1 血BUN、Cr、SOD、MDA的測定結(jié)果(±s)

表1 血BUN、Cr、SOD、MDA的測定結(jié)果(±s)

注：a, 與C組比較, P<0.05；b, 與A組比較, P<0.05；c, 與C組比較, P<0.05；d, 與A組比較, P<0.05

組別 例數(shù) BUN(mmol/L)Cr(μmol/L)SOD(U/ml)MDA(μmol/ml)A 10 14.25±2.13a 276.67±3.18a 170.45±14.27c 8.998±0.345c 10 9.40±2.60b 100.42±4.02b 241.69±19.00cd 6.206±0.599cd C 10 7.21±3.31 75.93±5.24 335.63±14.688 4.560±0.235 B

表2 各組Bcl-2、Bax蛋白表達情況及凋亡指數(shù)的比較(±s)

表2 各組Bcl-2、Bax蛋白表達情況及凋亡指數(shù)的比較(±s)

注：與C組比較, a, P<0.01, b, P<0.05；與A組比較, c, P<0.05, d, P<0.01

10 0.1430±0.02b 0.2029±0.03a 0.70±0.06a 28.5±4.4 B 10 0.2643±0.02d 0.1589±0.03c 1.65±0.15d 15.6±3.5c C 10 0.1125±0.05 0.1038±0.03 1.07±0.04 3.10±2.2組別 例數(shù) Bcl-2 Bax Bcl-2/Bax AI A

3 討論

藥理學(xué)研究表明黃芪具有補氣升陽、扶正祛邪、抗毒排膿、益氣利水等功效, 從西醫(yī)角度上講即具有抗炎、利尿、強心及促進免疫等多種作用, 近年來有研究發(fā)現(xiàn)黃芪還能降低自由基生成和增加自由基的清除作用［1,2］。研究表明黃芪的活性成分可以清除自由基, 預(yù)防生物膜的脂質(zhì)過氧化［3］。本實驗用黃芪注射液干預(yù)下, 黃芪治療組與缺血再灌注組比較, SOD活性和MDA含量差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), 提示該藥具有保護SOD的活性, 減輕脂質(zhì)過氧化損傷, 從而對腎臟缺血再灌注損傷具有保護作用, 這與國內(nèi)楊岳等［4］報道相一致。細胞凋亡不同于細胞壞死, 前者是由特定的基因調(diào)控實現(xiàn)的, 是維持機體自身穩(wěn)定的重要機制之一。細胞凋亡可參與缺血再灌注損傷, 但確切機制仍未闡明。Bcl-2家族是目前最受重視的凋亡相關(guān)基因家族。Bcl-2可阻止細胞凋亡, Bax可促進細胞凋亡。本研究通過對凋亡調(diào)控基因Bcl-2和Bax的檢測發(fā)現(xiàn), 正常情況下, 在腎小球和腎小管區(qū)Bax表達較弱, 而Bcl-2在腎小管區(qū)表達較強, 在總體上這兩類基因處于相對平衡狀態(tài)。當應(yīng)用黃芪治療后, 觀察到Bax的表達明顯下調(diào), 而Bcl-2基因表達顯著增強, 細胞凋亡明顯減輕, 腎小管細胞得到保護, 這與張春軍等［5］研究結(jié)果相吻合。通過凋亡指數(shù)的測定發(fā)現(xiàn)：黃芪治療組和缺血再灌注組腎臟細胞凋亡指數(shù)與對照組相比較顯著升高, 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01), 黃芪治療組腎臟細胞凋亡指數(shù)顯著低于缺血再灌注組(P<0.05), 因此認為黃芪對腎臟缺血再灌注損傷具有保護作用, 其機制可能部分是通過調(diào)節(jié)凋亡調(diào)控基因Bcl-2和Bax的表達來降低細胞凋亡指數(shù)實現(xiàn)的。

［1］張金國, 高東升, 魏廣和, 等.黃芪注射液對急性心肌梗死早期患者左室重塑及心功能的影響.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志, 2002,22(5):346-348.

［2］蘇群, 方強.黃芪與牛磺酸對急性病毒性心肌炎患者血脂質(zhì)過氧化物的影響.浙江預(yù)防醫(yī)學(xué), 2001, 13(6):9-10.

［3］許靜, 秦小紅, 薛梅.黃芪對D-半乳糖衰老大鼠脂質(zhì)過氧化及紅細胞免疫功能的影響.江蘇醫(yī)藥, 2007, 33(6):596-597.

［4］楊岳, 謝席勝, 艾娜, 等.黃芪三七合劑對大鼠腎缺血再灌注損傷的作用及機制研究.華西醫(yī)學(xué), 2013, 28(4):500-504.

［5］張春軍, 董琦, 董凱, 等.黃芪對大鼠腦缺血再灌注損傷c-fos和Bcl-2表達及細胞凋亡的影響.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報, 2011,28(4):425-427.