金針菇原生質體制備和再生探究

陳鵬　郭成金

摘要：采用正交試驗方法對影響金針菇[Flammulina velutipes（Curt.：Fr.）Sing.]原生質體制備、再生的主要因素進行探究，結果表明，金針菇原生質體最佳再生體系為：培養7 d的菌絲體，在1%溶壁酶、1%蝸牛酶組成的混合酶中，以0.6 mol/L MgSO4·7H2O作為滲穩劑，在30 ℃下酶解4 h，經過3次驗證試驗，金針菇原生質體再生率高達0.851 7。最佳制備體系為：培養9 d的菌絲體，在2%溶壁酶中，以0.6 mol/L蔗糖作為滲穩劑，在26 ℃下酶解4 h，此條件下金針菇原生質體的制備率高達2025×107個/mL。

關鍵詞：金針菇；正交試驗；原生質體；再生；融合；誘變

中圖分類號： S646.1+50.36文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）09-0200-05

收稿日期：2013-12-03

基金項目：國家星火計劃 （編號：2012GA610002）

作者簡介：陳 鵬（1989—），女，天津人，碩士研究生，主要從事蕈菌生物學研究。Tel：（022）23765561；E-mail：630261583@qq.com。

通信作者：郭成金，教授，主要從事植物細胞營養及蕈菌生物學研究。Tel：（022）23765561；E-mail：chengjin@vip.sina.com。金針菇[Flammulina velutipes（Curt.：Fr.）Sing.]別稱冬菇、樸菇、構菌、青杠菌、毛柄金錢菌等，隸屬擔子菌亞門（Basidiomycotina）層菌綱（Hymenomycetes）傘菌目（Agaricales）口蘑科（Tricholomataceae）金錢菌屬（Flammulina）[1]。金針菇菌蓋滑嫩、菌柄細長脆質、形美、味鮮，富含多種維生素、礦物質，不含膽固醇，富含賴氨酸、精氨酸，能促進幼兒大腦發育[2]。金針菇藥用價值很高，金針菇具有抗腫瘤、護肝作用，是世界上著名的觀賞菌、食藥兼用菌，是目前工廠化生產技術最成熟的菇類之一[3-4]。原生質體指將細胞壁破除后由質膜包裹的裸露的細胞結構[5]。1973年，有學者將原生質體融合技術運用到蕈菌研究領域。目前原生質體融合技術已成為研究蕈菌生理、生化、遺傳等基礎理論、改良菌種的重要方法。有學者采用單因素試驗對金針菇原生質體制備、再生進行了研究，但再生率均不高[6-7]。筆者在前人的基礎上首次采用正交試驗方法對影響金針菇原生質體制備、再生條件進行優化，旨在為開展金針菇原生質體融合、誘變研究提供依據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌種金針菇保藏種由天津師范大學蕈菌研究所提供。

1.1.2試劑葡萄糖、蔗糖、甘露醇、KH2PO4、K2HPO4、MgSO4·7H2O、維生素B1、KCl、NaCl、瓊脂（天津福晨化學試劑廠）、溶壁酶（廣東省微生物研究所）、蝸牛酶、纖維素酶（北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司）、馬鈴薯、棉籽皮、玉米粉。

1.1.3儀器與設備YXQG02手提式壓力蒸汽消毒器（山東新華醫療器械廠）、SW-CJ-2FD雙人單面凈化工作臺（蘇州凈化設備有限公司）、WDP型微生物多用培養箱（廣東省醫療器械廠）、TGL-16G高速冷凍離心機（上海安亭科學儀器廠）、BS224S電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司）、HH-S恒溫水浴鍋（江蘇省醫療儀器廠）、血球計數板（上海求精生化試劑儀器有限公司）、Galen光學顯微鏡（Gambrige公司）、針頭式濾器、0.22 μm微孔濾膜（北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司）。

1.1.4培養基PDA綜合培養基：馬鈴薯 20.00%（浸提液）、棉籽皮20.00%（浸提液）、葡萄糖 2.00%、KH2PO4 030%、MgSO4·7H2O 0.15%、維生素B1 0.0004%、瓊脂 200%，pH值自然[8]。液體培養基：玉米粉 3.00%（浸提液）、馬鈴薯15.00%（浸提液）、葡萄糖 0.50%、KH2PO4 002%、KH2PO4 0.08%、MgSO4·7H2O 0.05%、pH值 6.0～65。再生培養基：液體培養基+0.8%瓊脂，以0.6 mol/L甘露醇配得，pH值自然。再生對照培養基：液體培養基+08%瓊脂，以蒸餾水配得，pH值自然。滲穩劑：甘露醇、蔗糖、KCl、NaCl 均為0.6 mol/L。

1.2方法

1.2.1菌絲體的培養取斜面培養基上經提純復壯后生長旺盛的菌絲體尖端接種于液體培養基表面，25 ℃靜置培養 5～11 d，每隔24 h手搖1次。

1.2.2酶液的配制按表1稱取各種酶置于4 mL離心管中，用相應滲穩劑溶解，經0.22 μm微孔濾膜過濾除菌后備用。

1.2.3原生質體的分離在無菌操作下取培養好的菌絲體濕質量約500 mg置于4 mL離心管中，6 000 r/min離心 10 min，棄上清液，用相應的滲穩劑洗滌3次，用無菌濾紙吸去多余水分。4 mL離心管中，每100 mg濕菌絲體加1 mL酶液，每管放入2粒直徑為2.5 mm的無菌玻璃珠，在恒溫水浴鍋中進行酶解。吸取1～10 μL酶解液，用血球計數板計算原生質體的初步得率。

1.2.4原生質體的純化酶解一定時間后，用孔徑為18 μm的無菌濾網過濾原生質體懸液，除去殘余的菌絲體片段。濾液4 000 r/min離心10 min，棄上清液，用滲透壓穩定劑洗滌3次，得到純化的原生質體。吸取少許懸液，置于顯微鏡下觀察，用血球計數板計算原生質體最終得率。

1.2.5原生質體再生將純化的原生質體懸液稀釋至濃度為105個/mL，吸取0.2 mL涂布在再生培養基上，另取0.2 mL用無菌水稀釋的原生質體懸液涂布在對照培養基上，作為對照。培養8～15 d后記錄再生菌落數，每處理重復3次，再生率計算公式如下：endprint

原生質體再生率=（再生菌落數-對照組再生菌落數）/涂布的原生質體總數×100%。

2結果與分析

2.1原生質體的釋放方式

金針菇原生質體有4種釋放方式。酶解反應初期無原生質體釋放，但菌絲出現斷裂，菌絲變粗、變短且膨大，在菌絲頂端部位細胞的細胞壁被溶解，原生質體從細胞壁缺口溢出，原生質體呈球形，通常金針菇菌絲以這種方式從缺口釋放1～2個原生質體。0.5 h后，菌絲慢慢變得疏松，菌絲側面出現孔洞，原生質體從側面被釋放出來。隨著酶解時間的延長，一些菌絲細胞壁橫隔被溶解，大部分菌絲裂解成菌絲段，原生質體從菌絲段的一端或兩端釋放出來。當酶解比較徹底時，質壁分離，在內外環境的壓力下，原生質體從孔洞溢出，呈串珠排列在原位（圖1）。

2.2影響原生質體制備的因素

由表2可知，各因素對原生質體制備率的影響由大到小依次為：酶組成及濃度>酶解時間>滲穩劑>菌齡>酶解溫度。最佳原生質體制備條件組合為A2B4C1D4E3。即培養9 d的菌絲體，在2%溶壁酶中，以0.6 mol/L蔗糖作為滲穩劑，在26 ℃下酶解4 h，此條件下金針菇原生質體的制備率高達2025×107個/mL，原生質體大小均勻、質膜完整、平滑明亮（圖2）。

2.3影響原生質體再生的因素

胞分裂和萌發3個相互聯系又具有一定獨立性的生理過程，是細胞自我修復的過程。它有利于克服菌種退化，保持菌種自身的優良性狀。原生質體制備條件直接影響原生質體的再生能力，因此采用正交試驗對影響原生質體制備的5個因素進行研究。由表3可知，各因素對原生質體再生影響程度由大到小依次是酶解時間>酶組成及濃度>滲穩劑>酶解溫度>菌齡。最佳原生質體制備條件組合為A3B1C3D4E2。即培養7 d的菌絲體，在1%溶壁酶、1%蝸牛酶組成的混合酶中，以0.6 mol/L MgSO4·7H2O作為滲穩劑，在30 ℃下酶解4 h。經過3次驗證試驗，金針菇原生質體再生率高達8517%，與前人研究得到的金針菇再生率相比提高了60%[6]。

2.4滲穩劑種類與原生質體再生的關系

參照表3的金針菇原生質體最佳再生條件：培養7 d的菌絲體，在1%溶壁酶、1%蝸牛酶組成的混合酶中，以 0.6 mol/L MgSO4·7H2O作為滲穩劑，在30 ℃下酶解4 h，比較不同滲穩劑對金針菇原生質體再生率的影響。

由表4可知，以甘露醇、蔗糖作為滲穩劑，金針菇再生率高于無機鹽類，尤其以甘露醇作為滲穩劑時金針菇再生率最高，再生菌落長出的時間也最短；以NaCl作為滲穩劑時，金針菇再生率最低，且再生菌落長出的時間也最長。4種不同的再生培養基中，原生質體的再生率相差較大，這可能是由于滲穩劑的種類不同導致原生質體對其利用、轉化的速度也不同。不同滲穩劑培養基上的菌落長勢如圖3所示。

2.5原生質體再生情況

在最佳滲穩劑的再生培養基上暗培養4 d可以看到一個半透明的白色印記，邊緣不規則，呈輻射狀。5～7 d時，菌落的痕跡變得清晰，呈白色不規則的圓形，以再生點為中心輻射狀生長。8 d以后，菌落向四周擴大，金針菇的氣生菌絲比較旺盛，隨著時間的推移，輻射狀愈加明顯，邊緣不規則，且開始分泌色素，中心泛黃，邊緣菌絲白色，最終再生菌落布滿整個再生培養基（圖4）。

3結論與討論

3.1原生質體制備的相關因素

3.1.1酶液組成對原生質體制備率的影響蕈菌的細胞壁較復雜，使用酶法破壁制備原生質體時，酶很關鍵。復合酶的酶解效果較單一酶效果好。溶壁酶是一種活力很強的復合酶[9]。本研究表明，單獨使用溶壁酶比使用其他混合酶的效果要好，這與前人研究結果[10-12]一致。由于高濃度的酶液對原生質體有一定的損傷作用，酶解過于徹底會影響原生質體再生，為提高原生質體的活力，采用較低濃度的酶液配比，結果表明，2%溶壁酶效果最好。

3.1.2滲穩劑對原生質體制備率的影響原生質體制備中，滲透壓穩定劑不僅能保護原生質體免于因滲透壓差值過大而破裂，而且有助于酶與底物結合[13]。細胞破壁后，原生質體表3原生質體再生正交試驗結果與極差分析

3.1.3酶解溫度對原生質體制備率的影響隨著溫度的增加，酶易失活，原生質體也易破損，產量不再增加。25～37 ℃溫度范圍內，酶解反應都能進行，但對于不同的酶體系來說，最適的酶解溫度不同[15]。本研究表明，26 ℃時金針菇原生質體產量最高，這與前人研究結果[6]一致。

3.1.4酶解時間對原生質體制備率的影響本研究表明，隨著酶解時間的延長，菌絲逐漸變得疏松，開始斷裂，原生質體制備率逐漸增加，隨著酶解時間的延長，原生質體制備率有增加的趨勢，酶解4 h，制備率最高達2.025×107個/mL。

3.1.5菌齡對原生質體制備率的影響菌齡是影響原生質體釋放的重要因素，菌絲體的不同生理狀態直接影響細胞壁的結構、菌絲體代謝水平。菌齡過短，酶解時原生質體易破裂，穩定性差[16]。以菌齡為9 d的金針菇菌絲體制備原生質體時原生質體產量最高，但隨著培養時間的延長，原生質體產量下降，可能是由于老齡化菌絲細胞壁較厚，菌絲細胞壁上容易沉積色素等次生物質，酶的作用減弱，原生質體產量減少，故最佳菌齡為9 d。

3.2再生相關因素的原生質體

3.2.1酶液組成對原生質體再生率的影響本研究表明，用混合酶制備出的原生質體再生率高于用單一酶制備出的原生質體再生率。用1%溶壁酶、1%蝸牛酶組成的混合酶制備出的原生質體再生率最高，達0.851 7，這與之前的最佳制備酶條件不同，因為適合原生質體制備的條件不一定適合其再生。有文獻報道，破壁后的適量細胞壁組分可促進細胞壁的再生[17]。本研究表明，經酶解后一定量的細胞殘壁可以作為合成細胞壁的“引物”，有助于細胞壁再生。endprint

3.2.2滲穩劑對原生質體再生率的影響滲透壓穩定劑的主要作用是維持原生質體內外滲透壓的平衡[18]。無機鹽類不利于再生可能是因為鹽對細胞壁降解有促進作用。筆者認為，原生質體再生體系的作用是促進細胞壁的形成以及胞內各細胞器、超分子復合物功能修復及均衡養分。原生質體制備體系及再生體系的共性在于細胞滲透壓的穩定。

3.2.3酶解溫度對原生質體再生率的影響酶解溫度也影響原生質體再生。本研究表明，金針菇原生質體再生率隨著溫度的升高有上升的趨勢，當溫度超過30 ℃時，再生率開始下降，高溫會損傷原生質體活性，進而影響其再生，所以金針菇原生質體再生的最適溫度為30 ℃。

3.2.4酶解時間對原生質體再生率的影響本研究表明，酶解1～2 h，原生質體釋放不徹底，再生率較低；酶解4 h時，原生質體釋放較完全，原生質體結構功能也較完整，再生率最高。

3.2.5菌齡對原生質體再生率的影響本研究表明，菌齡為7 d時，金針菇原生質體再生率最高，小于或超過7 d菌齡，菌絲細胞或過于幼嫩或已老化均不易被酶解，原生質體活力弱，再生率呈下降趨勢。菌齡過短的菌絲細胞經酶解破壁形成的原生質體，有的細胞器不完全，功能尚未完善，再生能力較低。由于處在生長對數期的細胞內含物多、功能完善，所以原生質體再生率高、再生時間短。菌齡過長同樣不適合再生，由于細胞壁較老，酶解困難，整個原生質體可能從酶解所生成的小孔中流出。

4結論

本研究通過正交試驗對金針菇原生質體制備、再生條件進行優化，得到金針菇原生質體最佳再生體系為：培養7 d的菌絲體，在1%溶壁酶、1%蝸牛酶組成的混合酶中，以 0.6 mol/L MgSO4·7H2O作為滲穩劑，在30 ℃下酶解4 h，經過3次驗證試驗，金針菇原生質體再生率高達0.851 7。最佳制備體系為：培養9 d的菌絲體，在2%溶壁酶中，以 0.6 mol/L 蔗糖作為滲穩劑，在26 ℃下酶解4 h，此條件下金針菇原生質體的制備率高達2.025×107個/mL，原生質體大小均勻、質膜完整、平滑明亮。

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3.2.2滲穩劑對原生質體再生率的影響滲透壓穩定劑的主要作用是維持原生質體內外滲透壓的平衡[18]。無機鹽類不利于再生可能是因為鹽對細胞壁降解有促進作用。筆者認為，原生質體再生體系的作用是促進細胞壁的形成以及胞內各細胞器、超分子復合物功能修復及均衡養分。原生質體制備體系及再生體系的共性在于細胞滲透壓的穩定。

3.2.3酶解溫度對原生質體再生率的影響酶解溫度也影響原生質體再生。本研究表明，金針菇原生質體再生率隨著溫度的升高有上升的趨勢，當溫度超過30 ℃時，再生率開始下降，高溫會損傷原生質體活性，進而影響其再生，所以金針菇原生質體再生的最適溫度為30 ℃。

3.2.4酶解時間對原生質體再生率的影響本研究表明，酶解1～2 h，原生質體釋放不徹底，再生率較低；酶解4 h時，原生質體釋放較完全，原生質體結構功能也較完整，再生率最高。

3.2.5菌齡對原生質體再生率的影響本研究表明，菌齡為7 d時，金針菇原生質體再生率最高，小于或超過7 d菌齡，菌絲細胞或過于幼嫩或已老化均不易被酶解，原生質體活力弱，再生率呈下降趨勢。菌齡過短的菌絲細胞經酶解破壁形成的原生質體，有的細胞器不完全，功能尚未完善，再生能力較低。由于處在生長對數期的細胞內含物多、功能完善，所以原生質體再生率高、再生時間短。菌齡過長同樣不適合再生，由于細胞壁較老，酶解困難，整個原生質體可能從酶解所生成的小孔中流出。

4結論

本研究通過正交試驗對金針菇原生質體制備、再生條件進行優化，得到金針菇原生質體最佳再生體系為：培養7 d的菌絲體，在1%溶壁酶、1%蝸牛酶組成的混合酶中，以 0.6 mol/L MgSO4·7H2O作為滲穩劑，在30 ℃下酶解4 h，經過3次驗證試驗，金針菇原生質體再生率高達0.851 7。最佳制備體系為：培養9 d的菌絲體，在2%溶壁酶中，以 0.6 mol/L 蔗糖作為滲穩劑，在26 ℃下酶解4 h，此條件下金針菇原生質體的制備率高達2.025×107個/mL，原生質體大小均勻、質膜完整、平滑明亮。

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3.2.2滲穩劑對原生質體再生率的影響滲透壓穩定劑的主要作用是維持原生質體內外滲透壓的平衡[18]。無機鹽類不利于再生可能是因為鹽對細胞壁降解有促進作用。筆者認為，原生質體再生體系的作用是促進細胞壁的形成以及胞內各細胞器、超分子復合物功能修復及均衡養分。原生質體制備體系及再生體系的共性在于細胞滲透壓的穩定。

3.2.3酶解溫度對原生質體再生率的影響酶解溫度也影響原生質體再生。本研究表明，金針菇原生質體再生率隨著溫度的升高有上升的趨勢，當溫度超過30 ℃時，再生率開始下降，高溫會損傷原生質體活性，進而影響其再生，所以金針菇原生質體再生的最適溫度為30 ℃。

3.2.4酶解時間對原生質體再生率的影響本研究表明，酶解1～2 h，原生質體釋放不徹底，再生率較低；酶解4 h時，原生質體釋放較完全，原生質體結構功能也較完整，再生率最高。

3.2.5菌齡對原生質體再生率的影響本研究表明，菌齡為7 d時，金針菇原生質體再生率最高，小于或超過7 d菌齡，菌絲細胞或過于幼嫩或已老化均不易被酶解，原生質體活力弱，再生率呈下降趨勢。菌齡過短的菌絲細胞經酶解破壁形成的原生質體，有的細胞器不完全，功能尚未完善，再生能力較低。由于處在生長對數期的細胞內含物多、功能完善，所以原生質體再生率高、再生時間短。菌齡過長同樣不適合再生，由于細胞壁較老，酶解困難，整個原生質體可能從酶解所生成的小孔中流出。

4結論

本研究通過正交試驗對金針菇原生質體制備、再生條件進行優化，得到金針菇原生質體最佳再生體系為：培養7 d的菌絲體，在1%溶壁酶、1%蝸牛酶組成的混合酶中，以 0.6 mol/L MgSO4·7H2O作為滲穩劑，在30 ℃下酶解4 h，經過3次驗證試驗，金針菇原生質體再生率高達0.851 7。最佳制備體系為：培養9 d的菌絲體，在2%溶壁酶中，以 0.6 mol/L 蔗糖作為滲穩劑，在26 ℃下酶解4 h，此條件下金針菇原生質體的制備率高達2.025×107個/mL，原生質體大小均勻、質膜完整、平滑明亮。

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