江蘇人群MICA 基因多態性與乙型肝炎源性肝癌的相關性研究

苗祥宇，徐麗，劉紅，張碩偉，吳情（江蘇省宿遷市人民醫院感染科 223800）

全球范圍內原發性肝細胞癌（HCC）發病率位居惡性腫瘤第5位，約55%的病例發生在國內［1］。多項研究已證實慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染是導致HCC 的重要原因之一，約有10%～25%HBV 感染患者最終發展為HCC［2］。在國內，90%以上HCC患者伴有HBV 感染［3］。近年來，越來越多的證據顯示，單核苷酸多態性（SNP）與腫瘤的遺傳易感性相關［4］。主要組織相容性復合體（MHC）－Ⅰ類鏈相關基因A（MICA）編碼一種應激誘導性配體，主要與自然殺傷細胞（NK 細胞）活化型受體NKG2D 特異性結合，在NK 細胞活化和免疫監視中發揮作用。研究發現，MICA 多態性與惡性腫瘤、感染性疾病以及自身免疫性疾病等的易感性有密切關系。本研究旨在探討MICA 基因多態性以及血清中可溶性MICA 抗原含量與乙型肝炎源性HCC的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料將2009年9月至2013年6月本院收治并經病理確診的HCC患者161例納入患者組，所有患者均為首次發病入院，未經過放射、化學治療的患者；其中男131例，女30例，患者年齡22～80歲，平均（47.2±12.5）歲；所有患者乙型肝炎表面抗原（HBsAg）均為陽性。將同期無血緣關系、在本院體檢健康者162例納入健康對照組，其中男130例，女32例；年齡24～74歲，平均（45.6±11.8）歲。兩組受試者性別、年齡等一般資料比較，比較差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA 提取基因組DNA 提取采用Wizard基因組DNA 純化試劑盒（美國Promega公司），操作嚴格按照說明書進行。分光光度計分析DNA 濃度和純度，將濃度調整為50ng／μL。

1.2.2 基因分型運用聚合酶鏈式反應（PCR）產物直接測序法對MICA 基因多態性位點rs2596542進行基因分型。引物序列為：上游5′－TCG TCT CCC AAA GAA CAG CTA C－3′，下游5′－CCA GTC TCT GGA GTC ACT GTC－3′。PCR 總反應體系為25μL，含DNA 模板1μL，2×PCR mix 12.5μL，上、下游引物各1μL，DNA 聚合酶0.5μL，去離子水9μL。PCR 預變性94℃5min，變性94℃30s、退火60℃30s、延伸72℃30s，35個循環，72℃延伸7min。PCR 擴增產物片段為492bp。

1.2.3 血清MICA 水平檢測采用酶聯免疫吸附法（ELISA）、人MICA 檢測試劑盒（美國Sigma－Ald rich公司），操作按照說明書進行操作。所有樣品均設3個復孔，設置酶標儀波長450nm，讀取吸光度值，根據MICA 標準品檢測結果繪制標準曲線，計算樣品濃度。

1.3 統計學處理采用SPSS13.0軟件對數據進行處理及統計學分析，計量資料采用表示，組間比較采用t檢驗；計數資料采用百分率表示，組間比較采用卡方檢驗。Logistic回歸分析法計算比值比（OR）及95%置信區間（95%CI），以α＝0.05為檢驗水準，P＜0.05為比較差異有統計學意義。

2 結果

2.1 既往史與家族史比較患者組中有吸煙史、飲酒史、HCC家族史者明顯高于健康對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 患者組和健康對照組的既往史與家族史比較（n）

2.2 MICA 基因多態性與HCC風險經Hardy－Weinberg平衡檢驗，健康對照組和患者組MICA 基因位點rs2596542基因型實際值與預測值比較，均符合Hardy－Weinberg 平衡（χ2＝2.344，P＝0.125和χ2＝3.420，P＝0.064）。患者組中GG 基因型的分布頻率為23.6%，明顯高于健康對照組的16.0%，比較差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。進一步分析發現，GG 基因型攜帶者HCC 發病風險是AA 基因型攜帶者的1.860倍（OR＝1.860，95%CI：1.009～3.428）。攜帶G 等位基因者HCC 發病風險高于A 等位基因攜帶者（OR＝1.412，95%CI：1.030～1.936）。

表2 rs2596542基因型在患者組與健康對照組的分布［n（%）或n］

2.3 MICA 基因多態性與血清MICA 水平本研究采用ELISA 方法對HCC患者和健康體檢者血清MICA 水平進行檢測，發現患者組MICA 水平為（55.1±21.3）pg／mL，明顯高于健康對照組的（9.7±4.3）pg／mL，比較差異有統計學意義（P＜0.05）。進一步分析MICA 基因多態性與血清MICA 水平的關系，結果顯示，GG 基因型患者血清MICA 水平為（89.1±41.7）pg／mL，明顯高于AA 基因型的（18.2±9.5）pg／mL和AG 基因型的（35.8±17.4）pg／mL，比較差異有統計學意義（P＜0.05）。

3 討論

MICA 基因是MIC基因家族的成員之一。MICA 是功能基因，在人體正常組織細胞表達量極低［5］。研究發現，MICA基因在大多數上皮來源的原發性腫瘤，如肝癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌等細胞上表達，被認為與惡性轉化有關［6］。NK 細胞活化受體NKG2D 可以識別表達在腫瘤細胞表面的MICA／B。這些識別無須抗原處理和遞呈，并且無MHC 限制性。MICA／B與NKG2D 結合刺激NK 細胞的活化。膜MICA 可上調效應細胞NKG2D 的表達，而膜MICA 可被基質金屬蛋白酶水解釋放入血液。可溶性MICA 的釋放不僅降低腫瘤細胞表面MICA 的表達，降低腫瘤的免疫原性，也能影響免疫效應細胞表面NKG2D 的表達，進而影響NK 細胞和細胞毒性T 淋巴細胞（CTL細胞）抗腫瘤效應的發揮。張彩等［7］的研究也表明，可溶性MICA 通過降低NKG2D 的表達下調機體的抗腫瘤免疫效應。上述研究表明，NKG2D－MICA 的相互作用可有效調節NK 細胞和CTL細胞的殺腫瘤作用。本研究發現，乙型肝炎源性HCC 患者血清MICA 水平明顯高于健康對照組（P＜0.05），說明可溶性MICA 在肝癌發生中發揮重要作用，這種作用與腫瘤免疫逃逸作用機制有關。

人類MHC基因域位于6號染色體短臂，共含有224個基因座，包含MIC家族7個成員的編碼基因，其中MICA 位于經典MHC－Ⅰ類基因域著絲粒的末端，具有6個外顯子，由5個內含子隔開［8］。Kumar等［9］發現MICA 上游4.7kb的變異位點與丙型肝炎病毒引起的HCC 相關。Paulisally等［10］研究了MICA 基因多態性與丙型肝炎源性肝癌的關系，發現SNP rs2596538與丙型肝炎源性肝癌易感性相關。有研究發現，另一個MICA SNP位點rs2596542與乙型肝炎源性HCC 易感性相關，G 等位基因攜帶者HCC發病風險明顯大于A 等位基因攜帶者［11］。本研究結果與Kumar等［9］的研究類似，GG 基因型攜帶者比AA 基因型攜帶者乙型肝炎源性HCC發病風險高；或至少攜帶1個G 等位基因者比攜帶A 等位基因者更易患乙型肝炎源性HCC。SNP rs2596538G 等位基因攜帶者血清MICA 水平高于A 等位基因攜帶者，rs2596542G 等位基因攜帶者高于A 等位基因的攜帶者。本研究也發現，GG 基因型HCC患者血清MICA 水平明顯高于AA 基因型和AG 基因型患者（P＜0.05）。回歸分析結果顯示，GG 基因型攜帶者比AA 基因型攜帶者乙型肝炎源性HCC發病風險要高。上述研究結果表明，MICA 基因多態性可能通過提高可溶性MICA 水平，從而影響HCC易感性。

綜上所述，隨著分子生物學、細胞生物學和人類基因組學、蛋白質組學等基礎學科向癌癥研究領域的延伸，HCC 分子診斷方法取得了長足的進展［12］。MICA 基因多態性和血清MICA 有可能成為乙型肝炎源性HCC 的生物學標記。其在臨床診斷中的作用有待進一步研究。

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