冠心舒通對腦缺血再灌注大鼠學習記憶能力及腦組織Bcl-2、Bax蛋白表達的影響①

汪 偉 李冬梅 馬洪喜(長春大學特殊教育學院，長春 130022)

腦血管病是臨床常見病、多發病，其發病率、病死率逐年升高，在這一疾病相應的治療過程中發現腦缺血再灌注(Cerebral ischemia-reperfusion，I/R)的病理生理過程起著重要的作用［1］。近年來研究發現腦I/R損傷與細胞凋亡有著密切的關系，凋亡機制參與腦I/R損傷已成為臨床研究的熱點［2］。以往研究表明，冠心舒通具有調整、改善心血管功能的作用，它能減輕心肌缺血程度及減小梗塞面積、能降低血漿纖維蛋白原含量、抑制血小板黏附性和聚集性、改善血液流變性、增加冠脈血流量及改善心肌的供血供氧，對心肌缺血再灌注損傷有明確的保護作用［3-5］，但對冠心舒通能否影響腦I/R損傷的研究甚少，本實驗通過檢測大鼠學習記憶能力及細胞凋亡的調控，旨在探究冠心舒通是否對腦I/R損傷具有保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑 冠心舒通膠囊(咸陽步長制藥有限公司生產，每粒裝0.3 g，國藥準字Z20020055，產品批號100101);兔抗鼠Bcl-2和Bax抗體購于北京博奧森生物有限公司;SP和DAB試劑盒購于福州邁新生物有限公司;ELISA試劑盒購于南京建成生物有限公司。

1.2 模型的制作 采用線栓法，結扎大鼠左側頸總動脈建立腦I/R模型。選長約5 cm、直徑0.24 mm的美國進口尼龍實驗栓線。用10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉，麻醉滿意后四肢及頭部固定，頸部正中做2 cm豎切口，先分離左側頸總動脈，再分離左頸內動脈及頸外動脈，避免刺激迷走神經，沿頸內動脈向上走行分離翼腭動脈，結扎根部。假手術組僅暴露頸總動脈其他不作處理。造模成功標準清醒后評定:(1)右側前肢屈曲，不能完全伸展;(2)提尾時，右側前肢抓力減弱;(3)提尾時向右側轉圈;(4)自由運動時，無方向性，向右側轉圈或傾倒;(5)不能自發行走，意識喪失。造模成功后2 h將栓線拔出形成再灌注模型。

1.3 動物分組及給藥 健康的Wistar大鼠60只(吉林大學白求恩醫學部動物實驗中心提供，動物許可證號:SCXK2007-吉大-0003)。體重(210±20)g，每組15只，隨機分為假手術組、腦I/R模型組、冠心舒通組;冠心舒通組依據大鼠長期毒性試驗分為:高劑量(1 g/kg)組和低劑量(0.5 g/kg)組，冠心舒通將其研磨制成懸濁液。造模前每組分別每日灌胃給予生理鹽水、生理鹽水、冠心舒通高劑量和冠心舒通低劑量，連續7 d;缺血120 min后松扎，傷口撒頭孢唑啉鈉粉末0.25 g后逐層縫合，放回籠中飼養;假手術組僅分離頸總動脈，不做任何處理;術后每天上午灌胃給予生理鹽水、生理鹽水、冠心舒通高劑量和冠心舒通低劑量，3 d后水迷宮訓練同時繼續給藥，連續7 d。

1.4 動物檢測選取 實驗結束后，去除死亡的和狀態極差的大鼠，每組各取10只檢測。

1.5 檢測指標

1.5.1 Morris水迷宮測試 測試潛伏期、經過平臺次數和平臺象限停留時間，Morris水迷宮訓練7 d后，于第8天測試。

1.5.2 大鼠血清中Bcl-2和Bax蛋白水平的檢測采用ELISA法檢測，嚴格按試劑盒說明書操作。

1.5.3 大鼠腦組織的病理改變 采用HE染色觀察，常規石蠟包埋，切片5 μm，光學顯微鏡下觀察。

1.5.4 大鼠腦組織中Bcl-2和Bax蛋白水平的檢測

采用免疫組織化學-SP法檢測，切片3 μm，嚴格按試劑盒說明書進行。光學顯微鏡下觀察結果:細胞質陽性呈棕黃色，蘇木精復染細胞核呈藍色。

1.5.5 大鼠腦組織中Bcl-2和Bax mRNA水平的檢測 引物序列由上海生物工程公司合成。Bcl-2;上游引物5'-CACATCTGGAGACTATAAGA-3'，下游引物5'-CTCTAAGTTGCGTTATCTAC-3'，產物242 bp;Bax:上游引物5'-GCTAATGGAGGAGAAGAAGT-3'，下游引物 5'-CTGACCTGTTGGACCTTGTG-3'，產物298 bp;凝膠成像后用凝膠圖像分析系統分析結果。

1.6 統計學處理 采用SPSS13.0統計學分析軟件，測試潛伏期、經過平臺次數、平臺象限停留時間、大鼠血清中Bcl-2及Bax的蛋白水平和腦組織中Bcl-2、Bax的蛋白及mRNA水平，其數據均以表示，進行t檢驗。

2 結果

2.1 測試潛伏期、經過平臺次數和平臺象限停留時間的檢測 與腦I/R模型組比較，冠心舒通高劑量和低劑量組大鼠測試潛伏期均縮短、經過平臺次數均增多、平臺象限停留時間均增加，差異均有統計學意義(P＜0.01)，且冠心舒通高劑量組好于冠心舒通低劑量組，有顯著差異(P＜0.01);與假手術組比較，冠心舒通高劑量組大鼠測試潛伏期略延長、經過平臺次數和平臺象限停留時間略減少，但無顯著差異(P＞0.05)，冠心舒通低劑量組大鼠測試潛伏期延長、經過平臺次數和平臺象限停留時間減少，有顯著差異(P＜0.01)，腦I/R模型組大鼠測試潛伏期明顯延長、經過平臺次數和平臺象限停留時間明顯減少，有顯著差異(P＜0.01);見表1。

表1 各組大鼠測試潛伏期、經過平臺次數和平臺象限停留時間的比較(，n=15)Tab.1 Comparision of escape latency ，times to cross target area and average time spent in platform quadrant in different groups(，n=15)

表1 各組大鼠測試潛伏期、經過平臺次數和平臺象限停留時間的比較(，n=15)Tab.1 Comparision of escape latency ，times to cross target area and average time spent in platform quadrant in different groups(，n=15)

Note:1)P＜0.01 compared with sham-operated group;2)P＜0.01 compared with model group;3)P＜0.01 compared with high-dose group.

Groups Escape latency(s) Times to cross target area Average time spent in platform quadrant(s)Sham-operated group 31.47±3.61 2.76±0.38 21.45±3.16 Model group 56.39±4.031) 0.93±0.121) 8.14±1.011)High-dose group 36.42±2.962) 2.61±0.332) 20.66±3.522)Low-dose group 43.18±3.273) 1.82±0.573) 15.26±1.933)

2.2 腦組織的病理改變結果 HE染色結果 假手術組:腦組織細胞排列緊密整齊;模型組:腦組織細胞排列松散紊亂，細胞核濃縮，細胞質淡染;高劑量組:腦組織細胞排列比較緊密整齊;低劑量組:腦組織細胞排列較為緊密整齊，可見細胞核濃縮，細胞質淡染;見圖1。

圖1 腦組織的病理改變(HE染色，×200)Fig.1 Pathological changes in brain tissue(HE staining ，×200)

2.3 大鼠血清中Bcl-2和Bax蛋白的水平 與腦I/R模型組比較，冠心舒通高劑量和低劑量組血清中Bax蛋白含量降低、Bcl-2蛋白含量升高均有統計學意義(P＜0.01)，且冠心舒通高劑量組好于冠心舒通低劑量組，有顯著差異(P＜0.01);與假手術組比較，冠心舒通高劑量組大鼠血清中Bax蛋白含量略升高、Bcl-2蛋白含量略降低，但無顯著差異(P＞0.05)，冠心舒通低劑量組大鼠血清中Bax蛋白含量升高、Bcl-2蛋白含量降低，有顯著差異(P＜0.01)，腦I/R模型組大鼠血清中Bax蛋白含量明顯升高、Bcl-2蛋白含量明顯降低，有顯著差異(P＜0.01);見表2。

2.4 大鼠腦組織中Bcl-2和Bax蛋白表達的水平 與腦I/R模型組比較，冠心舒通高劑量和低劑量組大鼠腦組織中Bax蛋白含量降低、Bcl-2蛋白含量升高均有統計學意義(P＜0.01)，且冠心舒通高劑量組好于冠心舒通低劑量組有顯著差異(P＜0.01);與假手術組比較，冠心舒通高劑量組大鼠腦組織中Bax蛋白含量略升高、Bcl-2蛋白含量略降低但無顯著差異(P＞0.05)，冠心舒通低劑量組大鼠腦組織中Bax蛋白含量升高、Bcl-2蛋白含量降低有顯著差異(P＜0.01)，腦I/R大鼠腦組織中Bax蛋白含量明顯升高、Bcl-2蛋白含量明顯降低有顯著差異(P＜0.01);采用Motic Images Advanced 3.2圖像分析系統，灰度值越高陽性表達越低，灰度值越低陽性表達越高。見表2，圖2～4。

2.5 大鼠腦組織中Bcl-2和Bax mRNA的水平 凝膠成像后用凝膠圖像分析儀分析結果，與腦I/R模型組比較，冠心舒通高劑量和低劑量組大鼠腦組織中Bax mRNA水平降低、Bcl-2 mRNA水平升高均有統計學意義(P＜0.01)，且冠心舒通高劑量組好于冠心舒通低劑量組有顯著差異(P＜0.01);與假手術組比較，冠心舒通高劑量組大鼠腦組織中Bax mRNA水平略升高、Bcl-2 mRNA水平略降低但無顯著差異(P＞0.05)，冠心舒通低劑量組大鼠腦組織中 Bax mRNA水平升高、Bcl-2 mRNA水平降低，有顯著差異(P＜0.01)，腦 I/R模型組大鼠腦組織中 Bax mRNA水平明顯升高、Bcl-2 mRNA水平明顯降低有顯著差異(P＜0.01)。見表3。

表2 各組大鼠血清、腦組織中Bcl-2和Bax蛋白的比較(，n=15)Tab.2 Comparision of Bcl-2 and Bax protein expression in rat serum and brain tissues(，n=15)

表2 各組大鼠血清、腦組織中Bcl-2和Bax蛋白的比較(，n=15)Tab.2 Comparision of Bcl-2 and Bax protein expression in rat serum and brain tissues(，n=15)

Note:1)P＜0.01 compared with sham-operated group;2)P＜0.01 compared with model group;3)P＜0.01 compared with high-dose group.

Groups Serum(pg/ml)Brain tissue(gray value)Bcl-2 Bax Sham-operated group 7.45±1.03 5.27±1.14 100 Bcl-2 Bax.21±3.56 132.82±3.49 Model group 2.61±0.521) 10.16±1.351) 160.58±4.131) 82.12±2.061)High-dose group 7.09±1.122) 5.61±0.982) 110.65±2.712) 126.31±2.922)Low-dose group 5.03±0.763) 8.11±0.973) 136.72±3.463) 100.49±2.683)

圖2 腦組織中Bcl-2的表達(免疫組織化學染色 ，×200)Fig.2 Bcl-2 expression in brain tissue(Immunohistochemical staining ，×200)

圖3 腦組織中Bax的表達(免疫組織化學染色 ，×200)Fig.3 Bax expression in brain tissue(Immunohistochemical staining ，×200)

圖4 腦組織中Bcl-2和Bax蛋白的水平Fig.4 Protein levels of Bcl-2 and Bax in brain tissue

3 討論

近年來隨著腦血管病發病率的逐年上升，腦血管病成為臨床常見的三大致死疾病之一［6］，腦血管病尤其是缺血后再灌注損傷對腦的影響成為國內學者研究缺血性腦損傷的熱點。眾多的研究［7］表明腦缺血再灌注損傷過程中細胞凋亡發揮重要作用，機體的細胞凋亡過程中有多種蛋白參與調控，其中Bcl-2蛋白家族是人們研究最多的一類凋亡蛋白［8］，Bcl-2蛋白家族分布在線粒體外膜等處，分為兩大類:促凋亡類，如 Bid、Bax、Bak等，也就是 Bax能促進細胞凋亡;抑凋亡類，如Bcl-2、Bcl-X1等，也就是Bcl-2能抑制細胞凋亡;這兩類蛋白可通過形成異二聚體發揮相互拮抗或放大作用，因此研究Bcl-2和Bax的表達趨勢是決定細胞凋亡與否的主要因素。

表3 各組大鼠腦組織中Bcl-2和Bax的mRNA的比較(，n=15)Tab.3 Bcl-2 and Bax mRNA expression in brain tissue in different groups(，n=15)

表3 各組大鼠腦組織中Bcl-2和Bax的mRNA的比較(，n=15)Tab.3 Bcl-2 and Bax mRNA expression in brain tissue in different groups(，n=15)

Note:1)P＜0.01 compared with sham-operated group;2)P＜0.01 compared with model group;3)P＜0.01 compared with high-dose group.

Groups Bcl-2 Bax Sham-operated group 1.25±0.13 0.86±0.06 Model group 0.41±0.051) 1.92±0.241)High-dose group 1.18±0.092) 0.91±0.032)Low-dose group 0.83±0.113) 1.44±0.173)

冠心舒通膠囊由廣棗、丹參、丁香、冰片、天竺黃等組成［9］，其中廣棗的有效藥理成分為廣棗總黃酮，動物實驗表明能顯著延長小鼠的耗氧速度、提高小鼠耐缺氧的能力、顯著延長小鼠痛覺反應潛伏期(熱板法)或顯著減少醋酸刺激引起的扭體反應次數［10］;天竺黃對離體兔耳血管有直接擴張作用，小鼠實驗有顯著抑制毛細血管通透性作用［10］;丹參的有效成分是丹參酮臨床試驗結果表明能改善冠心病、心絞痛和胸悶等癥狀［12］，且以往的研究［13-15］表明:廣棗能抑制心肌細胞凋亡誘導腫瘤細胞凋亡;丹參抗神經元細胞及血管內皮細胞凋亡且能促進腫瘤細胞凋亡;丁香、冰片及天竺亦具有抗海馬神經元凋亡和促進腫瘤細胞凋亡的作用，其根本在于這5種有效成分能通過阻止線粒體膜電位的下降和線粒體膜通透性轉換孔的開放，抑制線粒體促凋亡的蛋白質如細胞色素C、凋亡誘導因子(AIF)等的釋放，從而防止細胞凋亡發生。因此本實驗復制大鼠腦I/R損傷模型，給予高、低劑量的冠心舒通后檢測大鼠學習記憶能力及腦組織Bcl-2和Bax的蛋白及mRNA的表達水平，實驗結果表明冠心舒通高劑量和低劑量組大鼠測試潛伏期均縮短、經過平臺次數均增多、平臺象限停留時間均增加(P＜0.01)，且冠心舒通高劑量組好于冠心舒通低劑量組有顯著差異(P＜0.01);冠心舒通高劑量組血清和腦組織中Bax蛋白含量及 mRNA水平略升高、Bcl-2蛋白含量及mRNA水平略降低但無顯著差異(P＞0.05)，低劑量組大鼠血清和腦組織中Bax蛋白含量及mRNA水平升高、Bcl-2蛋白含量及mRNA水平降低有顯著差異(P＜0.01)，腦I/R模型組大鼠血清和腦組織中Bax蛋白含量及mRNA水平明顯升高、Bcl-2蛋白含量及mRNA水平明顯降低有顯著差異(P＜0.01)，提示冠心舒通能提高腦I/R損傷大鼠的學習記憶能力;能下調Bax蛋白、上調Bcl-2蛋白的水平對腦I/R損傷大鼠的腦組織具有保護作用;并證實冠心舒通高劑量組好于低劑量組，這是冠心舒通治療缺血性腦血管病作用機制之一，其他機制有待于進一步的研究。

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