紫杉醇-順鉑聯合藥物控釋系統對肺腺癌細胞系A549細胞生長的抑制作用

崔 永 柳明亮 吳炳群 段新春 龔 民

(首都醫科大學附屬北京友誼醫院胸外科，北京100050)

肺癌的發病率及病死率均為惡性腫瘤的第一位，非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)占80%以上，總體預后不佳。化療是一種重要的治療方法。為提高化療療效同時降低不良反應，需要提高藥物的局部濃度、延長藥物作用時間并增加針對淋巴系統的靶向性。靜電紡絲法制備載藥纖維構建給藥系統(drug delivery system，DDS)藥物包封率高、穩定性好，而且能夠實現控釋給藥及植入給藥，已成為研究的熱點。既往制備紡絲載藥纖維面臨的困難主要是藥物釋放速率的控制和多藥聯合載藥。本研究采用靜電紡絲技術，制備了聚碳酸亞丙酯(poly propylene carbonate，PPC)為藥物載體的紫杉醇(Taxol)、順鉑(cisplatinum)兩藥聯合控釋系統(TP-DDS)，得到微米甚至納米級的載藥纖維膜。本研究的主要目的是觀察該系統對體外培養的肺腺癌細胞系A549細胞的抑制作用。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

人肺腺癌細胞系A549，由首都醫科大學藥學系實驗室提供，屬傳代細胞系，可穩定傳代培養。紫杉醇標準品購自勝天宇生物科技有限公司;順鉑購自齊魯制藥有限公司;PPC購自內蒙古蒙西高新技術集團有限公司;左旋聚乳酸(PLLA)，相對分子質量50萬，購買于山東醫療器械研究所;海藻酸鈉、乙腈、氯化鈣購買于北京化學試劑有限公司。試驗所需各種空白或載藥纖維膜均由清華大學高分子實驗室制備。

1.2 試驗方法

1.2.1 細胞培養

從液氮罐中取出A549細胞凍存管，在經紫外線照射消毒20 min的37℃溫水中融化;1 000～2 000 r/min，3～5 min離心;在無菌操作臺中以75%的乙醇徹底擦拭凍存管后，用1 mL槍頭去除上清液，再加入1 mL預熱的細胞培養液將細胞吹散，移至25 cm2培養瓶中;補充4 mL的RPMI 1640培養基，并添加10%的胎牛血清;倒置顯微鏡下觀察，37℃、5%CO2培養;24 h后更換新的培養液。常規傳代培養。

1.2.2 分組

共分為8個組，分別為紫杉醇單藥DDS、順鉑單藥DDS、兩藥DDS、紫杉醇裸藥、順鉑裸藥、兩藥裸藥、PPC空白和完全空白對照組。在各藥物組中，均分別采用4個級別的藥物濃度，紫杉醇分別為0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.4 mg/L、0.8 mg/L，順鉑分別為 0.4 mg/L、0.8 mg/L、1.2 mg/L、1.6 mg/L。

1.2.3 實驗干預

將細胞接種于96孔板，密度為1×104細胞/孔，將培養板置于37℃，5%CO2飽和濕度培養箱內培養;24 h后取出培養板，無菌條件下去除舊培養液，加入不同濃度的控釋藥物，每組分3個亞組，最終結果取平均值，并分別設置對照組，加入培養箱內繼續培養;48 h后取出培養板，加入20 μL噻唑藍，放入培養箱內繼續培養;4 h后，將培養板取出，將細胞內噻唑藍與線粒體酶發生反應后形成的紫藍色結晶物于倒置顯微鏡下觀察;去上清液，每孔內加入150 μL二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，水平搖床振動10～15 min;用酶標儀在490 nm波長下，測定吸光度(opacity absorption，OA)，計算藥物對腫瘤細胞抑制率:(對照組OA值-實驗組OA值)/對照組OA值。

2 結果

2.1 紫杉醇DDS和紫杉醇裸藥對肺腺癌A549細胞生長的抑制作用

紫杉醇DDS對A549細胞的抑制作用明顯強于紫杉醇裸藥組，但兩組對A549細胞抑制率并未隨藥物濃度升高而表現出升高的趨勢。PPC空白組對A549細胞基本無抑制作用，詳見圖1。

圖1 紫杉醇DDS和紫杉醇裸藥對肺腺癌A549細胞生長的抑制曲線Fig.1 Growth inhibition effect of taxol(DDS/naked)on A549 cells

2.2 順鉑DDS和順鉑裸藥對肺腺癌A549細胞生長的抑制作用

順鉑DDS組和裸藥組的細胞生長抑制作用均呈現良好的量效曲線。而且DDS組對A549細胞的抑制作用更為明顯，PPC空白組對A549細胞基本無抑制作用，詳見圖2。

2.3 兩藥DDS和兩藥裸藥對肺腺癌A549細胞生長的抑制作用

兩藥DDS和兩藥裸藥對A549細胞的抑制率均隨藥物濃度的升高而遞增。兩藥DDS對A549細胞的抑制作用更為明顯。PPC空白組對A549細胞基本無抑制作用，詳見圖3。

圖2 順鉑DDS和順鉑裸藥對肺腺癌A549細胞生長的抑制曲線Fig.2 Growth inhibition effect of cisplatin(DDS/naked)on A549 cells

圖3 兩藥DDS和兩藥裸藥對A549細胞的抑制曲線Fig.3 Growth inhibition effect of two medicines(DDS/naked)on A549 cell

3 討論

肺癌發病率和病死率均居惡性腫瘤的首位，肺癌中80%以上是非小細胞肺癌(NSCLC)［1-2］。化療是NSCLC主要的治療手段之一。紫杉醇+順鉑兩藥聯合方案是NSCLC標準一線化療方案之一。目前常規化療用藥方式是通過靜脈輸注的方式進行全身化療或稱系統化療，此種給藥方式難以在腫瘤局部維持足夠時間和濃度，也難以進入淋巴結和淋巴管。總體而言，化療單藥有效率僅為20% ～30%，新藥兩藥聯合化療的有效率也僅在40%左右［3］。理想的化療藥物需在腫瘤部位濃度高而正常組織濃度較低，同時能延長在腫瘤局部的作用時間。為提高對腫瘤細胞的殺傷并減少化療的不良反應，需要提高腫瘤局部化療藥物濃度并延長作用時間。新型給藥系統(drug delivery system，DDS)的研究或許可以給NSCLC化療帶來新的選擇。在之前的研究［4］中筆者采用靜電紡絲法，以聚碳酸亞丙酯(PPC)聯合負載紫杉醇和順鉑制備了控釋載藥纖維。本研究的目的是驗證與裸藥相比，該系統在抑制肺腺癌細胞系A549方面的優勢。

本實驗結果顯示，無論是紫杉醇或順鉑單藥DDS，還是兩藥聯合DDS，對A549細胞的抑制作用均明顯強于相應的裸藥組。而且，在順鉑-DDS組和兩藥-DDS組，腫瘤抑制率隨藥物濃度的增加而呈明顯的上升趨勢。這表明本研究制備的DDS，對體外培養的腫瘤細胞的抑制率強于裸藥。

在應用靜電紡絲技術制備載藥纖維研究方面最早取得成功的是Baldoni等［5］，他們率先制備出快速、緩慢、延時等不同釋放性能的載藥纖維。在抗腫瘤藥物研究領域，Xie等［6］率先以可降解的聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)纖維負載紫杉醇制備出直徑在數十納米至十微米的纖維氈，紫杉醇的負載率達90%以上，體外釋放試驗證實紫杉醇緩慢釋放可達60余天。隨后他們又負載順鉑制備出芯鞘結構的微粒，順鉑釋放時間分別達到35 d和75 d(順鉑其他劑型的緩釋藥物釋放時間不超過14 d)，其體外毒性實驗均優于順鉑裸藥。Xu等［7］以可降解材料聚乙二醇-聚乳酸(PEG-PLLA)負載卡氮芥(BCNU)紡絲成控釋給藥系統，在體外細胞毒性實驗中，對腦膠質瘤細胞的殺傷作用，BCNU裸藥僅維持48 h，而負載BCNU的PEGPLLA可以維持72 h以上。

Chen等［8］以聚乳酸為載體，采用電紡法負載二氯二茂鈦(titanocene dichloride)制備出納米纖維，對人肺癌細胞系spca-1行毒性實驗，結果顯示:當二氯二茂鈦濃度為 40、80、160、240 mg·L-1時，其對細胞的抑制率分別為11.2%、22.1%、44.2%、68.2%。Xie等［9］采用混合電紡的方式以聚乳酸聚丙烯(PELA)制備出負載羥喜樹堿(HPCT)的納米纖維，率先應用共紡物2-羥乙基-β-環糊精作為增溶劑，使不溶性、含有不穩定內酯環的HPCT在電紡纖維中具有較高的濃度，并調控其釋放速度。在細胞毒性試驗中，該藥物對于乳腺MCF-7細胞系的毒性較HPCT裸藥提高了7倍，在植入性化療藥物領域具有較好前景。Luo等［10］以不耐酸的 PBELA負載 HPCT紡絲(瘤體內通常為酸性環境)，在 pH等于6.8時對HepG2肝癌細胞的殺傷作用為pH等于7.2時的6倍。Amna等［11］以 PLGA負載喜樹堿/三氧化二鐵PCT/Fe2O3)制備出復合纖維氈，該紡絲藥物對鼠成肌細胞瘤C2C12也表現出了顯著的抑制作用。

在腫瘤化療時常應用兩藥或多藥聯合化療方案，而將兩藥同時電紡可降低紡絲成本，并可更好體現聯合化療的優勢。其中一個難題是親水性藥物與疏水性藥物難以形成均一結構。Xu等［12］將親水性的阿霉素與疏水性的紫杉醇混合后高速攪拌形成水包油型乳液(W/O)，電紡形成含有兩藥的紡絲物，細胞毒性實驗顯示:兩藥共紡物較單藥者對C6膠質瘤具有更明顯的抑制作用，其動物試驗尚在研究之中。紫杉醇屬細胞周期特異性藥物，對G2晚期和M有效，水溶性差，其溶媒是導致嚴重過敏反應的主要原因。順鉑水溶性好，屬細胞周期非特異性藥物［13-14］。PPC是二氧化碳和環氧丙烷的交替共聚物，具有完全可生物降解能力以及良好的生物相容性，是目前材料醫學領域的常用材料，也是靜電紡絲領域的研究熱點［15］。

靜電紡絲法制備控釋載藥纖維已成為目前的研究熱點，該方式結合控釋給藥與局部給藥的雙重優勢，可以減少給藥間隔、維持解剖靶向區域的高藥物濃度并降低化療不良反應，具有較大的研究應用潛能。本研究證實前期制備的紫杉醇-順鉑-DDS，對體外培養的腫瘤細胞的抑制率強于裸藥，為進一步的體內試驗奠定了基礎。

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