二苯乙烯苷對PD模型小鼠干預作用的觀察及機制初探

張如意 張 麗 吳燕川 李 林*

(1.首都醫科大學宣武醫院藥物研究室 北京市老年病醫療研究中心 神經變性病教育部重點實驗室，北京100053;2.首都醫科大學宣武醫院中心實驗室，北京100053)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是最常見的老年神經退行性疾病之一，以震顫、僵直和運動不能為主要臨床表現。目前PD的治療主要為多巴胺(dopamine，DA)替代療法，但長期應用后藥物產生不良反應，療效隨時時間延長而逐漸減弱。隨著老齡化社會的進展，PD患者不斷增加，研制新的PD防治藥物具有重要的現實意義。

二苯乙烯苷(2，3，5，4’-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside，TSG)是傳統中藥何首烏的主要有效成分，具有抗氧化、抗衰老、調節細胞凋亡等作用［1-2］。前期的研究［3］發現TSG在體外通過增強線粒體功能、降低氧化應激途徑來減少N-甲基-4-苯基吡啶離子(1-methyl-4-phenylpyridinium，MPP+)引起的神經元死亡。鑒于線粒體功能障礙和氧化應激在PD發病中的重要作用，根據前期的細胞實驗結果，本研究擬采用1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP)制備擬 PD 小鼠模型，觀察TSG對多巴胺能神經元的保護作用，并探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

TSG由首都醫科大學宣武醫院藥物研究室自行研制，從何首烏中提取，純度70%，實驗中采用干粉劑量，溶于蒸餾水制成藥液，4℃保存。MPTP、辛烷磺酸鈉鹽(octyl sulfate sodium salt，OSA)、多巴胺(dopamine，DA)、二羥基苯乙酸(dihydroxyphenylacetic acid，DOPAC)、高香草酸(homovanillic acid，HVA)、二羥基苯甲胺(3，4-dihydroxybenzylamine，DHBA)均購自美國Sigma公司。高氯酸購自北京化學試劑公司。甲醇為天津四面體化工廠色譜純試劑。

1.2 主要儀器

小鼠爬桿測定裝置和小鼠自主活動程序儀(CS-2型)購自中國醫學科學院藥物研究所;小鼠轉棒式疲勞儀(YLS-4C型)購自濟南益延科技發展有限公司;高效液相色譜儀為美國ESA公司產品;高速冷凍離心機(T21型)為美國杜邦公司產品。

1.3 實驗動物及分組

C57BL小鼠，雄性，SPF級，體質量18～22 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物許可證號:SCXK(京)2011-0011。MPTP直接溶于無菌0.9%(質量分數)氯化鈉注射液中，調節其終質量濃度為3 mg/mL。小鼠應用數字表法隨機分為4組。對照組:蒸餾水灌胃2周后，腹腔注射與模型組等容積的0.9%(質量分數)氯化鈉注射液5 d;模型組:蒸餾水灌胃2周后，MPTP 30 mg/kg連續腹腔注射5 d;TSG小劑量組和大劑量組:分別灌胃給予TSG 60 mg/kg和120 mg/kg 2周后，MPTP 30 mg/kg連續腹腔注射5 d。

1.4 小鼠爬桿實驗

參照秦博文等［4］的方法略作修改:給予MPTP腹腔注射前2 d，先進行小鼠爬桿訓練，引導動物10 s內由桿頂爬至桿底，每只每天訓練3次。正式測定時，記錄給予MPTP腹腔注射1 h后各組小鼠的爬桿時間，連測5 d，取均值。具體測定方法為:持小鼠尾部，將其頭向下置于桿頂部(以小鼠雙后肢置于球上為準)，讓其自然爬下，記錄小鼠自桿頂至雙前肢接觸桿底平臺所需時間。

1.5 小鼠自發活動記數測定

參照參考文獻［5］的方法應用自主活動程序儀測定小鼠自發活動記數。當計算機進入測定程序后，將小鼠放入高13 cm、直徑25 cm活動箱中，由計算機自動記錄小鼠活動情況，測定每只小鼠5 min內的活動次數。

1.6 小鼠轉棒實驗

參照Liu等［6］的方法略作修改:測定開始前3 d對小鼠進行轉棒訓練，每日上、下午各1次，訓練時間3 min。正式測定時，給予MPTP腹腔注射后70 min測定小鼠在轉棒上的停留時間，測定時間3 min，轉速10 r/min，連續測定3 d，取均值進行統計學處理。

1.7 高效液相色譜法對腦組織單胺類神經遞質及其代謝產物的測定

小鼠MPTP腹腔注射5 d后，斷頭處死，取紋狀體，凍于-80℃冰箱。參照Rekha等［7］的方法進行樣品處理和測定。樣品處理:紋狀體組織準確稱質量，按照1∶10的比例加入0.4 mol/L高氯酸，制備組織勻漿，高速冷凍離心機12 000 g/min，4℃離心15 min。取上清，再次于12 000 g/min，4℃離心15 min。取上清10 μL，應用高效液相色譜電化學法測定各組大鼠紋狀體內多巴胺。標準品配制:標準品溶于流動相中，使用時稀釋到10 ng/mL，進樣量10 μL。色譜條件:安捷倫公司碳十八反相色譜柱，洗脫液:70 mmol/L乙酸鈉，50 mmol/L檸檬酸，100 μmol/L乙二胺四乙酸二鈉，200 μmol/L辛烷磺酸鈉鹽，10%甲醇。調pH為4.1，過濾脫氣后使用，流量1.0 mL/min。檢測器工作電壓0.5 V，測定溫度29℃。

1.8 免疫組織化學法檢測酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)陽性細胞

每個實驗組取3只小鼠進行黑質處病理切片實驗。小鼠經4%多聚甲醛灌注固定。組織行冠狀面切片，片厚40 μm?？乖迯秃螅M織片用3%H2O2室溫孵育10 min，PBS緩沖液充分洗滌。10%羊血清室溫孵育30 min，加入一抗(稀釋度為1∶1 000)，4℃孵育過夜。PBS液充分洗滌。加入生物素標記的兔二抗(稀釋度為1∶200)，37℃水浴箱中保溫2 h，PBS液充分洗滌。加入辣根過氧化物酶標記的三抗(稀釋度為1∶200)，37℃水浴箱保溫60 min，PBS液充分洗滌。DAB顯色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。陰性對照的設立:以PBS緩沖液代替一抗行免疫組織化學染色，其余步驟同前。

1.9 統計學方法

數據應用SPSS 16.0軟件進行統計學分析。計量資料以均數±標準差(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TSG對MPTP模型小鼠爬桿時間的影響

爬桿時間反映小鼠的協調運動能力。動物協調性好，則自桿頂向下爬所需時間短。如圖1所示，MPTP模型組小鼠爬桿時間與正常對照組相比明顯延長(P＜0.01)，TSG大劑量用藥組小鼠爬桿時間比模型組縮短(P＜0.01)，差異有統計學意義，但與對照組相比差異無統計學意義。TSG小劑量用藥組小鼠爬桿時間與對照組相比延長，差異有統計學意義(P＜0.01)，與模型組相比差異無統計學意義。

圖1 TSG對MPTP模型小鼠爬桿時間的影響Fig.1 Effect of TSG on pole test in MPTP model mice

2.2 TSG對MPTP模型小鼠轉棒實驗的影響

以轉棒實驗測試各組小鼠運動協調性。實驗結果顯示，MPTP模型組小鼠在棒時間較對照組顯著縮短(P＜0.01)，TSG大劑量用藥組小鼠與對照組比，其在棒時間縮短(P＜0.05)，卻可延長造模后小鼠的在棒時間(P＜0.05)，差異有統計學意義，詳見圖2。TSG小劑量用藥不能延長小鼠在棒時間。

圖2 TSG對MPTP模型小鼠轉棒實驗的影響Fig.2 Effect of TSG on Rota rod test in MPTP model mice

2.3 TSG對MPTP模型小鼠自主活動次數的影響

自主活動次數反映了動物的隨意運動能力。如圖3所示，MPTP模型組小鼠與正常對照組相比，自主活動次數減少，差異有統計學意義(P＜0.01)。TSG高劑量用藥組小鼠自主活動雖較對照組減少(P＜0.01)，但卻較模型組增加(P＜0.01)，差異有統計學意義。

圖3 TSG對MPTP模型小鼠自主活動的影響Fig.3 Effect of TSG on spontaneous movement in MPTP model mice

2.4 TSG對MPTP模型小鼠紋狀體內多巴胺及其代謝產物含量的影響

應用高效液相色譜電化學法檢測小鼠腦紋狀體內多巴胺及其代謝產物的質量濃度。如圖4所示，MPTP模型組小鼠腦紋狀體內DA及其代謝產物DOPAC和HVA的質量濃度較對照組都降低，差異有統計學意義(P＜0.01)，TSG大劑量用藥組與對照組相比，DA和DOPAC的質量濃度雖降低，但與模型組小鼠相比則有增加，差異均有統計學意義(P＜0.01，P ＜0.05)。

圖4 TSG對MPTP模型小鼠腦紋狀體內多巴胺及其代謝產物含量的影響Fig.4 Effect of TSG on level of dopamine and its metabolites in striatum of MPTP model mice

2.5 TSG對MPTP模型小鼠黑質酪氨酸羥化酶陽性細胞的影響

應用免疫組織化學法檢測的結果如圖5所示，與正常對照組相比，MPTP模型組小鼠黑質TH陽性神經元數量較對照組減少，差異有統計學意義(P＜0.01)。TSG大劑量用藥組小鼠黑質處TH陽性細胞數量與對照組相比下降，但較模型組顯著增加，差異有統計學意義(P＜0.05)。

3 討論

本研究采用的MPTP腹腔注射模型被公認是理想的PD動物模型之一，已被廣泛用于PD發病機制及藥物作用機制的研究［8］。本研究中，重復給予MPTP腹腔注射可以引起小鼠的行為異常，模型小鼠出現尾僵直、豎毛、自主活動減少等，其持續時間一般約為4～6 h。而TSG用藥組小鼠的癥狀表現較輕，持續時間較短。為了客觀評價藥物的作用，本研究采用了爬桿實驗、轉棒實驗和自主活動記數多種行為學聯合的檢測方法。結果顯示，模型組小鼠運動協調性下降，表現為爬桿時間延長，轉棒實驗中的在棒時間縮短;同時，模型小鼠出現顯著的自主活動減少。TSG用藥組小鼠的行為學與模型組相比有明顯的改善。

PD的主要病理改變是黑質多巴胺能神經元的進行性變性死亡，導致紋狀體多巴胺含量降低，乙酰膽堿系統功能相對亢進，丘腦-皮質反饋活動和皮質發出的隨意運動受到過度抑制，導致患者出現運動和非運動癥狀［9］。多巴胺及其代謝產物減少是PD的主要神經生物化學改變指標。中腦黑質紋狀體DA的測定是衡量治療PD是否有效的最客觀指標［10］。TH是多巴胺生物合成中的限速酶，被作為多巴胺能神經元的特異性標志物。因此，本研究應用高效液相色譜法檢測了DA及其代謝產物，應用免疫組織化學染色法檢測黑質處TH陽性神經元的改變，以期評價TSG的神經保護作用。實驗結果顯示，模型組小鼠黑質處TH陽性神經元的數量較對照組明顯減少，紋狀體處DA及其主要的降解產物DOPAC和HVA都有顯著的下降。以上結果表明，擬PD模型小鼠黑質-紋狀體中DA能神經元損傷明顯，經黑質-紋狀體通路投射到紋狀體的DA神經遞質減少，從而引起紋狀體內DA、DOPAC和HVA降低。TSG用藥后，小鼠黑質處TH陽性神經元數量較模型組有明顯的增加，紋狀體中DA和DOPAC都有增加，HVA有一定程度的升高，但差異無統計學意義。在PD患者殘存的DA神經元內，主要通過B型單胺氧化酶(monoamine oxidase B，MAO-B)將DA催化降解成 DOPAC。楊秀偉等［11］的研究顯示，何首烏醇提物可能通過抑制MAO-B的活性而影響腦DA降解代謝，從而提高DA及DOPAC的質量濃度。結合本試驗結果，筆者推測，TSG可能通過保護和激發殘留 DA神經元的功能，抑制MAO-B的活性，提高DA神經元攝取血中的酪氨酸，保護和提高TH的活性，促進DA生成，在此基礎上進一步改善模型動物的運動協調性，增強模型小鼠的自主活動能力。

圖5 TSG對MPTP小鼠黑質TH陽性細胞的影響Fig.5 Effect of TSG on counts of TH positive neurons in substantia nigra(SN)of MPTP model mice

氧化應激-自由基學說在PD的發病機制中占有重要的地位［12］。目前，在天然藥物中尋找減少腦部氧化應激，具有保護神經細胞的抗PD藥物成為研究熱點［13］。Li等［14］的研究發現 TSG 具有較強的抗氧化作用。本課題組前期的研究［15］表明TSG能夠增高老年大鼠海馬區神經生長因子及其受體質量濃度，具有神經元保護作用。綜上所述，TSG可能具有防治神經退行性疾病如PD的應用價值。

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