兩種碘化丙啶染色DNA定量方法檢測HL-60細胞凋亡結果的比較

徐曉雪 戶乃麗 孫麗娜 孔 璐

(1.首都醫科大學醫學實驗與測試中心，北京100069;2.首都醫科大學基礎醫學院藥理學系，北京100069;3.首都醫科大學基礎醫學院生物化學與分子生物學系，北京100069)

碘化丙啶(propidium iodide，PI)是插入性核酸染料，直接插入雙鏈核酸的2個堿基對之間，每5個堿基插入1個熒光分子，與核酸的結合均勻、穩定。細胞經過RNA酶處理后，PI可以與細胞內DNA特異性結合，在流式細胞儀上經488 nm激光激發，發出峰值610～620 nm的熒光，可以準確的反映細胞群體中DNA含量的分布情況，適用于DNA定量檢測。根據細胞周期中不同時項DNA的變化來檢測細胞周期中DNA合成前期(G0/G1期)、DNA合成期(S期)與DNA合成后期(G2期)各時項的細胞比例。因為PI是適用于所有流式細胞儀的染料，這一染色技術在臨床腫瘤診斷和醫學科研中被普遍的采用，常規使用的染色方法是包括固定、RNA酶處理、PI飽和染色3個關鍵步驟的3步法PI染色技術［1］。在一些研究中，當細胞在生理或病理條件下發生了凋亡，DNA損傷，細胞內DNA降低，也可以采用3步法PI染色檢測亞G1峰(也稱作凋亡峰)，用于凋亡細胞比例和特征的分析［2］。但是在實際應用中，由于凋亡時相的不同，當凋亡細胞中DNA損傷部分沒有完全脫出細胞時，往往檢測不到明確可辨的亞G1峰，敏感度較低。作為細胞凋亡檢測的經典方法之一的彗星檢測［3］，以細胞在電泳移動中DNA的遷移形態作為凋亡的特征指標，此技術中比較關鍵的一步即采用堿性高滲試劑使凋亡細胞中斷裂的DNA碎片脫出細胞，從而在電泳遷移中呈現出彗星尾樣的拖痕，本課題組利用類似方法，用高滲緩沖液作用于固定后的懸浮細胞，使凋亡細胞內斷裂DNA較徹底的脫出細胞外，再進行DNA定量檢測，提高對細胞凋亡的識別度和敏感性［4］。

本實驗以DNA合成抑制劑喜樹堿作用于對數生長期的HL-60細胞，促進細胞凋亡，并用Annexin V標記流式檢測確認細胞凋亡存在，比較了常規PI單色DNA定量檢測法與滲透法PI單色DNA定量檢測法檢測正常和凋亡細胞樣品的結果，同時對各組細胞進行了形態學觀察。

1 材料和方法

1.1 材料

對數生長期HL-60細胞由首都醫科大學化學生物學與藥學院化學生物學系提供;1 mmol/L喜樹堿溶液(Sigma公司，美國);異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)Annexin V染色試劑(BD公司，美國);10×Annexin V結合緩沖液(BD公司，美國);70%(體積分數)乙醇溶液(蒸餾水配制，4℃預冷);磷酸氫鈉-檸檬酸緩沖液(DNA抽提緩沖液，pH 7.8，192 mL 0.2 mol/L Na2HPO4，8 mL 0.1 mol/L 檸檬酸，4℃保存);0.002%RNAse溶液(2 mg RNAse，0.1 mL Triton X-100，100 mL PBS，pH 7.2 ～7.4，新鮮配制);0.05%PI染液(5 mg PI，0.1 mL Triton X-100，10 mL PBS，pH 7.2～7.4，于4℃避光保存);EPICS@XL流式細胞儀(貝克曼公司，美國);TIS倒置熒光顯微鏡(尼康公司，日本)。

1.2 方法

1.2.1 分組

取對數生長期HL-60細胞以1×105/mL的密度接種于3個6孔板，每孔接種1.5 mL，用含體積分數為10%胎牛血清的RPMI-1640培養基在5%(體積分數)CO2，37℃，飽和濕度的細胞培養箱內培養48 h，其中9孔細胞作為正常培養對照，另外9孔細胞中各加入5 μL，1 mmol/L喜樹堿溶液，繼續培養2 h。分別收集各孔細胞，得到18個同步培養細胞樣品，取正常培養和刺激凋亡細胞各1例，進行FITC Annexin V標記凋亡檢測，驗證凋亡的存在，再將剩余16例樣品各自充分混勻后平均分入兩管，得兩兩一對的共32例樣品，分為4組，分別是正常培養細胞常規染色組，正常培養細胞滲透染色組，刺激凋亡細胞常規染色組，刺激凋亡細胞滲透染色組。

1.2.2 實驗步驟

1)凋亡檢測:對正常細胞和刺激凋亡細胞同時進行FITC Annexin V標記凋亡檢測。樣品離心，棄去上清，細胞計數，各取單細胞懸液含有3×105個細胞，加入5 μL Annexin V-FITC染液，充分混合，避光，室溫下孵育10 min，同時取相同量細胞加入5 μL PBS充分混合，避光，室溫下孵育10 min，作為未染色對照。再向樣本和對照管中分別加入10倍稀釋的結合緩沖液500 μL，避光，室溫下孵育5 min，全程采用無菌操作，流式細胞儀檢測。

2)PI染色DNA含量分析:樣品固定:將單細胞懸液充分吹打加入盛有5 mL 4℃ 70%(體積分數)乙醇的離心管中，充分混勻，置于4℃冰箱中固定4 h以上。洗滌:固定細胞離心棄去固定劑。對滲透處理染色組細胞增加磷酸氫鈉-檸檬酸緩沖液浸洗步驟:加入1 mL磷酸氫鈉-檸檬酸緩沖液，室溫孵育10 min，300 g(相對離心力單位，g=9.8 m/s2)離心5 min，棄上清，加入PBS充分混勻。RNA酶處理:將洗滌后棄去上清的各組細胞懸液各加入1 mL RNA酶溶液，37℃反應30 min，置于室溫冷卻。PI染色:向試管中加入0.1 mL PI染液，染色30 s，流式細胞儀檢測，Multicycle軟件進行周期分析。

3)顯微鏡觀察:每例PI染色標本在熒光倒置顯微鏡下進行形態學觀察，采集相差和熒光疊加圖像，同時顯示細胞結構和熒光標記情況。

1.3 統計學方法

各組DNA含量分析所得數據使用SPSS 12.0統計軟件進行分析，數據描述采用均數±標準差(±s)表示，將兩種不同染色方法檢測相同樣品得到的結果的百分數值進行配對t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 活細胞凋亡檢測結果

以流式細胞儀FITC通道檢測Annexin V標記情況，在FITC橫坐標熒光直方圖中，選取熒光高于對照樣品的細胞為陽性細胞群，P2門代表凋亡細胞。對照細胞P2=0.1%，正常細胞樣品P2=2.6%，刺激凋亡細胞樣品P2=31.7%。結果見圖1。

圖1 活細胞凋亡檢測結果Fig.1 FITC Annexin V apoptosis analyse

2.2 流式DNA含量分析結果

如圖2所示，A、B為正常HL-60細胞的兩種方法DNA定量結果，C、D為刺激凋亡細胞的兩種方法DNA定量結果，各組數據統計分析結果詳見表1，對于正常細胞兩種方法檢測結果差異無統計學意義，對于刺激凋亡細胞兩種方法檢測結果差異有統計學意義。

2.3 熒光顯微鏡觀察結果

鏡下可見(圖3)細胞經過RNA酶處理后細胞核形態清晰，PI染色明確。常規染色法:正常細胞組細胞呈聚集分布，胞膜光滑、完整，胞核圓形，染色均勻，可見分裂項，胞質可見;滲透染色法:正常細胞組呈單個分布，胞膜光滑、完整，胞核圓形，染色均勻，可見分裂項;常規染色法:刺激凋亡組細胞呈聚集分布，胞膜褶皺增多，稍不完整，染色較均勻，分裂項形態不清晰;滲透染色法:刺激凋亡細胞組呈單個分布，部分細胞發生胞膜皺縮、包膜破裂，胞核皺縮或松散，核染色變淡或染色區縮小，可見空細胞。

3 討論

圖2 DNA含量直方圖Fig.2 DNA content histograms of corresponding

表1 各組DNA含量分析數據統計結果Tab.1 The statistical analysis of the data of DNA content analysis (%)

圖3 PI染色HL-60細胞相差與熒光疊加圖像Fig.3 Phase contrast and fluorescence overlay photographys of HL-60 cells stained with PI

作為DNA定量檢測的經典方法的PI染色法被認為可以作為觀察細胞凋亡的重要手段之一，但是由于致凋亡因素、凋亡程度及細胞自身條件的差異，僅采用PI 3步法DNA定量檢測難以清晰的呈現凋亡特有的亞G1峰，更多的時候可見凋亡細胞的細胞周期出現不規則變化，主要的原因可能在于經過固定凋亡細胞DNA損傷后的DNA碎片不能自由的脫出細胞外，造成DNA下降不明顯，對于發生在S期和G2/M期的凋亡尤其如此，即使是發生在G0G1期的凋亡，也有可能僅表現為G0G1峰的變異度增加，而無法檢測到凋亡峰的存在。

為了增加PI染色法對凋亡的敏感程度，人們做過很多嘗試［4］，其中包括采用延時檢測，等待DNA自然脫出細胞后識別亞G1峰的方法，但隨意性大、可靠度低，并且無法控制，且受樣品凋亡的不同階段限制，效果不一。本試驗中的檸檬酸緩沖液即利用類似滲透原理，作用于固定后的懸浮細胞，經過滲透壓的變化，結合洗滌，使凋亡細胞內已斷裂的DNA松解后較徹底的脫出細胞外，再進行DNA定量檢測，由于其對正常細胞DNA含量沒有影響，所以可以明顯提高對細胞凋亡的識別度和敏感性。從形態學觀察中也看到滲透染色后刺激凋亡組細胞出現了較為多樣的改變，這可能和細胞所處周期時項不同及凋亡后變化多樣有關，但總體上可以發現細胞的胞膜在處理中都被保存，但細胞的核染色質降低，另外與正常染色組比較胞質明顯減少。

本實驗中用Annexin V標記活細胞凋亡檢測結果高于經磷酸氫鈉-檸檬酸緩沖液滲透后的PI染色檢測到的凋亡百分比，這可能是由于染色原理不同造成的凋亡檢測時項不同，Annexin V特異性與細胞表面磷酯酰絲氨酸結合，在細胞凋亡早期即可出現特征性的膜磷酯酰絲氨酸外翻，較DNA反應更早出現。但是Annexin V標記法更適合于活細胞樣品檢測，無法對儲存樣品進行檢測，并且試劑價格相對昂貴，操作要求無菌，受結合緩沖液中成分影響較大，結果不可重復［5］。

本文介紹的磷酸氫鈉-檸檬酸緩沖液滲透后PI染色DNA定量法具有流式實驗快速、準確、定量的特點，并且具有經典PI染色DNA定量分析方法簡便、經濟、適用范圍廣，可檢測儲存樣品的優點，不僅適用于科研，也可以用于快速檢測臨床患者的血液、骨髓等樣本，對于化學治療患者細胞損傷情況的檢測有一定意義［4，6-7］。由于采用了滲透抽提斷裂DNA的步驟，檢測的準確度明顯提高，與傳統方法比較提高了對凋亡細胞的識別敏感度，又保留了傳統DNA定量檢測的全部優點。這一DNA抽提的方法與DNA凝膠電泳以及彗星檢測的技術原理類似，檢測的敏感度相當，所適用的凋亡或DNA損傷程度也相當。實驗中需要注意的是有些細胞由于DNA脫出可能形成空細胞，在流式圖中表現為細胞群體中DNA含量極低的有形顆粒，這些也應計入凋亡細胞。

此檢測方法也有不足，在有些損傷條件下如果原G2M期細胞DNA含量稍許降低后并不一定會出現在低于G1峰的位置，也可能藏于G1-G2M期內，造成凋亡比例的低估，在具體操作中較好的解決方法是對比兩種檢測方法的檢測結果，未經抽提的細胞更多的提示損傷或凋亡細胞所處的周期時相，滲透抽提后發生變化的部分提示凋亡細胞的比例，兩者對應可以大體判斷凋亡的細胞周期時相和比例。

對于喜樹堿致凋亡HL-60細胞模型，經過高滲溶液DNA碎片抽提的PI單色DNA定量檢測法能夠更為清晰準確的呈現出細胞周期中的凋亡峰，同時對正常細胞DNA定量檢測沒有明顯影響，將兩種細胞的檢測結果對比可以初步推斷本試驗中細胞凋亡發生在細胞周期的S期時相。

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