塞來昔布聯(lián)合NK細胞對裸鼠人肝癌皮下移植瘤生長的影響

陳 超，郭雪興，劉軍權(quán)，陳劍群

(1徐州醫(yī)學院，江蘇徐州221002;2中國人民解放軍第九七醫(yī)院;3徐州醫(yī)學院附屬醫(yī)院)

研究表明，環(huán)氧合酶(COX-2)在肝癌細胞中高表達，并與肝癌的分化程度、轉(zhuǎn)移、預后密切相關(guān)。特異性COX-2抑制劑塞來昔布通過誘導凋亡、減少增殖對多種肝細胞癌有顯著的抑制作用。自然殺傷(NK)細胞為機體固有免疫細胞，其抗瘤譜較廣，包括肝癌在內(nèi)的多種腫瘤在使用NK細胞輸注后得到緩解。但肝癌單一方案治療效果多不令人滿意，易產(chǎn)生耐藥性，且毒副作用大。為此，2013年4～11月，我們觀察了塞來昔布與NK細胞聯(lián)用對裸鼠人肝癌細胞SMMC-7721皮下移植瘤生長的影響，并初步探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性BALB/c(nu/nu)裸鼠40只，4周齡，體質(zhì)量18～20 g，購自中國科學院上海實驗動物中心。人肝癌SMMC-7721細胞株購自中國科學院上海細胞庫。SP免疫組化試劑盒和鼠抗人血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)單克隆抗體、Bcl-2兔抗人多克隆抗體、Bax兔抗人多克隆抗體、DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;原位細胞凋亡(TUNEL)檢測試劑盒購于Roche公司，核因子-κB(NF-κB)兔抗人單克隆抗體和caspase-3兔抗人單克隆抗體購于Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人肝癌 SMMC-7721細胞株在37℃、5%CO2條件下，置于含10%胎牛血清的DMEM細胞培養(yǎng)基中，采用0.25%的胰蛋白酶消化傳代。NK細胞的培養(yǎng)及鑒定:取健康人外周抗凝血10 mL，淋巴細胞分離液分離單個核細胞，用含500 U/mL rhIL-2的NK細胞培養(yǎng)基調(diào)整單核細胞密度為5×108/L，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每2 d換液1次，收集培養(yǎng)10 d的NK細胞，加入Per-CP-Cy5.5標記的CD3、FITC標記的CD56進行細胞表面標志檢測，同型對照為 PerCP-Cy5.5標記的IgG1和FITC標記的小鼠IgG2b。

1.2.2 裸鼠移植瘤模型構(gòu)建 無菌環(huán)境下，取對數(shù)生長期SMMC-7721細胞，制成細胞懸液，調(diào)整細胞密度至4×107/mL，接種于裸鼠右側(cè)背部皮下，每只注射0.1 mL，制備裸鼠移植瘤模型。

1.2.3 動物分組及給藥 隨機將裸鼠分為對照組、NK細胞組、塞來昔布組和聯(lián)合干預組，每組10只。塞來昔布組從接種后第3天起給予塞來昔布100 mg/kg灌胃，每天給藥1次，連續(xù)35 d;NK細胞組采用瘤內(nèi)注射NK細胞治療，每只瘤內(nèi)注射NK細胞懸液0.6 mL，每7 d注射1次，共注射5次;聯(lián)合干預組同時給予塞來昔布和NK細胞，給藥劑量及途徑與單用組相同;對照組同時給予灌胃和瘤內(nèi)注射等量生理鹽水。

1.2.4 腫瘤體積觀察及腫瘤抑制率計算 接種后第7、14、21、28、35 天用游標卡尺測量腫瘤長、短徑，計算腫瘤體積。腫瘤體積=π/6×(長徑×短徑2)，π取3.14。35 d后處死裸鼠，剝離完整腫瘤組織，記錄腫瘤質(zhì)量(瘤重)，計算腫瘤抑制率。腫瘤抑制率=(空白對照組瘤重-實驗組瘤重)/空白對照組瘤重×100%。

1.2.5 移植瘤 VEGF、Bax、Bcl-2、NF-κB、caspase-3表達檢測 ①腫瘤組織經(jīng)10%甲醛固定后，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片。②抗原修復。③3%H2O2去離子水孵育，去除內(nèi)源性過氧化物酶活性，PBS沖洗。④滴加封閉液封閉。⑤滴加適當比例的一抗稀釋液(用PBS稀釋，現(xiàn)配現(xiàn)用，VEGF為1∶300，Bax和 Bcl-2 為 1∶150，NF-κB 和 caspase-3 為1∶300)，37℃孵育2 h。⑥PBS沖洗。⑦滴加二抗工作液，37℃孵育15 min。⑧PBS沖洗。⑨滴加辣根過氧化物酶標記的卵白素工作液，37℃孵育15 min。⑩PBS沖洗，DAB顯色，自來水沖洗。進行復染、脫水、透明，用中性樹膠封片。檢測腫瘤組織中VEGF、Bax、Bcl-2、NF-κB、caspase-3 的表達情況，用軟件 Image Pro Plus軟件進行半定量分析處理。

1.2.6 移植瘤TUNEL檢測 石蠟切片經(jīng)脫蠟后，按Roche公司TUNEL檢測試劑盒說明操作。在光學顯微鏡下，隨機選擇10個高倍鏡視野，計數(shù)凋亡細胞，凋亡細胞的百分比作為凋亡指數(shù)(AI)，即AI=凋亡細胞數(shù)目/有核細胞的總數(shù)×100%。

1.2.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組常規(guī)病理HE染色觀察 對照組腫瘤細胞生長旺盛，核固縮較少，片狀壞死區(qū)面積較小，瘤組織內(nèi)及其周圍微血管豐富;各單用組均可見不同程度的片狀壞死，瘤組織內(nèi)及其周圍微血管均減少;聯(lián)合干預組可見大片細胞壞死。

2.2 各組移植瘤體積變化及治療結(jié)束后腫瘤質(zhì)量、抑瘤率比較 見表1、2。

2.3 各組移植瘤中 VEGF、Bcl-2、NF-κB、Ki-67、Bax和caspase-3表達比較 見表3。

表1 各組不同時間腫瘤體積比較(mm3，±s)

表1 各組不同時間腫瘤體積比較(mm3，±s)

注:與對照組相比，*P ＜0.05;與聯(lián)合干預組比較，ΔP ＜0.05;與塞來昔布組比較，#P ＜0.05

組別 n腫瘤體積7 d 14 d 21 d 28 d 35 d NK 細胞組 10 262.35 ± 63.36*Δ# 370.85 ±123.54*Δ# 588.79 ±275.02*Δ 832.04 ±353.99*Δ 1 014.42 ±480.42*Δ塞來昔布組 10 118.93±121.16*Δ 205.36±152.25*Δ 356.79±255.35*Δ 517.57±274.77*Δ 727.28±461.33*Δ聯(lián)合干預組 10 58.97 ± 43.64* 76.30 ± 41.03* 193.09 ±131.34* 298.94 ±238.74* 307.13 ±157.00*對照組 10 413.35 ±140.09 591.95 ±215.48 1 014.50 ±298.02 1 368.01 ±488.14 1 714.09 ±729.93

表2 各組治療結(jié)束后腫瘤質(zhì)量、抑瘤率比較

2.4 各組移植瘤細胞凋亡情況比較 對照組AI為1.32 ±0.34、NK 細胞組為 3.38 ±1.06、塞來昔布組為5.38 ±0.82、聯(lián)合干預組為9.52 ±1.02。各用藥組AI明顯高于對照組(P均＜0.05)，且聯(lián)合干預組明顯高于各單用組(P均＜0.05)。

3 討論

3.1 NK細胞及塞來昔布對腫瘤細胞的作用 NK細胞是機體抑制腫瘤生長的重要免疫監(jiān)視細胞［1］。研究表明，肝癌微環(huán)境中高表達NK細胞，在抗腫瘤細胞增殖方面具有重要作用，體外培養(yǎng)激活的NK細胞對肝癌細胞亦有明顯的殺傷作用［2，3］。塞來昔布為特異性COX-2抑制劑，具有廣泛的抗腫瘤效應。體內(nèi)研究證明，塞來昔布可抑制肝癌細胞增殖，促進細胞凋亡，抑制腫瘤新生血管形成等［4］。臨床研究發(fā)現(xiàn)，體外索拉非尼、γ-生育三烯酚、氟伐地汀等與塞來昔布聯(lián)用能增強塞來昔布對肝癌的抑制作用［5，6］。本研究發(fā)現(xiàn)，塞來昔布和NK細胞單用組較對照組腫瘤生長明顯緩慢，聯(lián)合干預組腫瘤生長最慢，瘤體體積、質(zhì)量最小，抑瘤率最高，與實驗預期一致。

表3 各組移植瘤中 VEGF、Bcl-2、NF-κB、Ki-67、Bax 和 caspase-3 達比較(±s)

表3 各組移植瘤中 VEGF、Bcl-2、NF-κB、Ki-67、Bax 和 caspase-3 達比較(±s)

注:與對照組相比，aP ＜0.05;與聯(lián)合干預組比較，bP ＜0.05;與塞來昔布組比較，cP ＜0.05

組別 n VEGF Bcl-2 NF-κB Ki-67 Bax caspase-3 NK細胞組 10 273 460±14 831abc513 110± 31 174abc 35 774±2 831abc1 711 700±337 577ab 84 589± 7 098abc 90 680±10 347abc塞來昔布組 10 114 940±20 317ab 133 600± 21 524ab 13 826±3 126ab1 367 700±152 867ab118 400± 6 925ab 235 740±20 294ab聯(lián)合干預組 10 29 512± 4 879a 31 420± 4 449a 7 354±1 860a 602 750±212 556ab211 550±17 993a 387 910±14 066a對照組 10 400 470±32 087 723 850±288 347 62 557±4 2732 457 000±395 397 30 441± 5 259 21 427± 5 821

3.2 塞來昔布聯(lián)合NK細胞對腫瘤組織生長、轉(zhuǎn)移的作用 肝癌是一種富血管性腫瘤，其生長、侵襲、轉(zhuǎn)移依賴于新生血管的形成。VEGF是目前最有效的促血管生長因子，在肝癌中高表達，對肝癌新生血管形成及腫瘤生長和轉(zhuǎn)移具有重要作用［7］。既往研究發(fā)現(xiàn)，肝癌細胞中COX-2的表達與VEGF呈正相關(guān)［8］，以VEGF及其受體 VEGFR為靶點的藥物能抑制體內(nèi)肝癌細胞生長和腫瘤血管生成［9，10］。本研究結(jié)果顯示，NK細胞組、塞來昔布組、聯(lián)合干預組移植瘤中VEGF的表達明顯低于對照組，且聯(lián)合干預組 VEGF的表達明顯低于各單用組，與 Xu等［11］報道一致。

3.3 塞來昔布聯(lián)合NK細胞對腫瘤細胞增殖的作用 Ki-67是一種細胞增殖核抗原，與細胞的有絲分裂過程密切相關(guān)［12］。Ki-67在正常細胞中一般不表達或者低表達，在腫瘤細胞中高表達，是目前標記腫瘤細胞增殖狀態(tài)和惡性程度的可靠指標［13］。本研究結(jié)果顯示，人肝癌細胞SMMC-7721移植瘤經(jīng)塞來昔布、NK細胞作用后，Ki-67蛋白表達水平較對照組顯著下降，且聯(lián)合干預組Ki-67蛋白表達水平較單用組顯著下降，提示塞來昔布和NK細胞聯(lián)用可能通過調(diào)節(jié)細胞周期，減少增殖期的細胞數(shù)目，達到抑制腫瘤細胞增殖的作用。

3.4 塞來昔布聯(lián)合NK細胞對腫瘤組織生長代謝的作用 NF-κB是一種轉(zhuǎn)錄因子蛋白，在腫瘤的生長中起到重要作用。研究表明，肝癌細胞中 NF-κB高表達，多種致癌因素可通過激活NF-κB促進細胞增殖、抑制凋亡、使細胞發(fā)生惡變并促進腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移，抑制NF-κB活性可以抑制肝癌細胞增殖、促進凋亡、增加肝癌細胞對化療藥物的敏感性、抑制炎癥、減少肝癌血管生成等［14］。本研究結(jié)果顯示，各用藥組移植瘤中NF-κB的表達均明顯低于對照組，聯(lián)合干預組NF-κB的表達明顯低于各單用組。進一步驗證了塞來昔布是通過抑制HepG2細胞NF-κB因子DNA結(jié)合活性和NF-κB因子p65蛋白的表達，從而抑制腫瘤細胞增殖，促進細胞凋亡，抑制腫瘤新生血管形成［15］。

3.5 塞來昔布聯(lián)合NK細胞對腫瘤細胞凋亡的作用 細胞凋亡的線粒體途徑通過Bcl-2家族促凋亡Bax/Bak基因與抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-xL基因的平衡來調(diào)控［16］。caspase是一組半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶［17］，其中 caspase-3 為凋亡執(zhí)行蛋白［18］。當Bcl-2/Bax升高，線粒體內(nèi)cyt-c向胞質(zhì)釋放，從而激活胞質(zhì)內(nèi)上游凋亡蛋白caspase-9的表達，caspase-9誘導其下游終末凋亡蛋白 caspase-3的分裂，使caspase-3從無活性形式分裂為17及19亞單位的活性形式，最終誘導細胞凋亡［19］。鑒于 Bcl-2、Bax、caspase-3對細胞凋亡的重要性，本研究觀察了各組移植瘤中Bcl-2、Bax、caspase-3表達情況，結(jié)果顯示，NK細胞組、塞來昔布組、聯(lián)合干預組移植瘤中Bcl-2的表達顯著低于對照組，聯(lián)合干預組Bcl-2的表達顯著低于各單用組，且各用藥組移植瘤中Bax和caspase-3的表達較對照組顯著增加，聯(lián)合干預組Bax和caspase-3的表達較單用組明顯增加。與Winfield 等［20］報道一致。

綜上所述，塞來昔布聯(lián)合NK細胞具有良好的協(xié)同增效作用，可明顯抑制裸鼠人肝癌細胞SMMC-7721皮下移植瘤的生長;其作用機制可能與促進凋亡受體通路上的Bax、caspase-3的表達，抑制VEGF、Bcl-2、NF-κB、Ki-67 的表達有關(guān)。

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