白介素13基因多態性與哮喘發病易感性的關系

席素雅，陳樹珍，劉建強，張 玲，王少穎

(1河北省胸科醫院，石家莊050000;2河北省老年病醫院)

哮喘是由多種炎癥細胞、細胞因子及炎癥介質參與的氣道慢性非特異性炎癥性疾病。目前認為，哮喘是由環境因素和遺傳因素共同作用所致的多基因遺傳病。近年研究發現，IL-13基因內含子區+1923C/T 多態性與哮喘發病密切相關［1～7］，但其基因多態性分布頻率因人群、種族以及生活環境的不同存在一定差異。2011年7月～2013年7月，我們對哮喘患者IL-13基因內含子區+1923C/T單核苷酸多態性進行檢測，以期從遺傳學角度探討其發病機制。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 同期選擇河北省胸科醫院收治的哮喘患者150例(哮喘組)，均符合中華醫學會呼吸病學分會哮喘學組2013年制定的《支氣管哮喘防治指南》標準［8］。其中男78例、女72例，年齡18～65歲。同期另擇該院體檢中心健康體檢者150例(對照組)，均無哮喘病史，無家庭及個人過敏史。其中男70例、女80例，年齡20～70歲。研究對象均為無血緣關系的北方漢族人，并除外罹患嚴重急慢性感染、腫瘤、心臟病及肝腎疾病者。兩組性別、年齡具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 所有研究對象取外周血3 mL，加入含1.5 mg/mL乙二胺四乙酸二鈉的抗凝管中，搖勻，常規酚—氯仿法抽提基因組DNA，-20℃冰箱儲存備用。

1.2.2 基因型檢測 采用聚合酶鏈反應—限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)技術擴增基因組DNA。IL-13基因內含子區+1923C/T引物序列參照文獻［9］:引物Ⅰ:5'-GGCTGAATATCCATGGTGTGTGTCC-3'，引物Ⅱ:5'-GGCTGAGGTCGGCTAGGCTGAAGAC-3'。25 μL PCR 反應體系:10 × 緩沖液2.5 μL，4 × 脫氧三磷酸核苷(10 mmol/L)2.0 μL，MgCl2(25 mmol/L)2.5 μL，10 μmol/L 引物各 1.0 μL，模板 DNA(10 μmol/L)3.0 μL，rTaq DNA 聚合酶(5 U/L)0.25 μL，去離子加至25 μL。擴增反應在熱循環儀上完成。循環參數:95℃預變性10 min，94℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環;最后72℃延伸5 min。PCR擴增產物用限制性內切酶BsaAⅠ于37℃水浴消化8 h，然后在3%瓊脂糖凝膠上加溴化乙錠(終濃度為0.7 μg/mL)，取8 μL酶切產物在凝膠上上樣電泳，紫外線燈照射下觀察拍照。

1.2.3 統計學方法 采用 SPSS13.0統計軟件。基因型的Hardy-Weinberg平衡符合程度判斷采用χ2檢驗。單個基因型及組間等位基因頻率比較采用四格表 χ2檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 IL-13基因型分析 IL-13基因內含子區+1923C/T多態性位點PCR擴增產物片段大小為559 bp。PCR產物經限制性內切酶消化后，電泳結果可見3種基因型:TT型(不含酶切位點的純合子，酶切產物為559 bp)、CC型(含有酶切位點的純合子，酶切產物為310、249 bp)、CT型(雜合子，產物為559、310、249 bp)。隨機選取3種基因型樣本的PCR產物進行測序，其結果與PCR-RFLP結果完全一致。酶切結果見圖1。

2.2 兩組IL-13基因內含子區+1923C/T基因型和等位基因分布頻率比較 經Hardy-Weinberg平衡檢驗，兩組基因型符合遺傳平衡，具有群體代表性(見表1)。兩組IL-13基因內含子區+1923C/T基因型及等位基因頻率比較見表2。哮喘組T等位基因(CT+TT基因型)攜帶者(118例，78.67%)明顯高于對照組(88 例，58.67%)(χ2=13.94，P ＜0.01)。

圖1 IL-13基因內含子區+1923C/T多態性PCR產物BsaAⅠ酶切電泳結果

表1 兩組IL-13基因內含子區+1923C/T基因型分布的Hardy-Weinberg平衡檢驗(%)

表2 兩組IL-13基因內含子區+1923C/T多態性基因型和等位基因頻率分布比較［例(%)］

3 討論

哮喘是一種由多種細胞、細胞因子和炎性介質引起的，以氣道高反應性為特征的變態反應性炎癥性疾病。細胞因子作為細胞間重要信息傳遞者，在哮喘的發病過程中起著極為重要的作用。近年來，哮喘的患病率和病死率呈逐年上升趨勢，已成為全球范圍內嚴重的公共衛生問題之一［10］。

IL-13在1993年Keystone細胞因子會議上被正式命名［11］，主要是由CD+4Th2細胞分泌的多效性細胞因子，具有多種免疫調節作用。編碼人IL-13的基因位于人染色體5q31，全長約4.6 kb，含有4個外顯子和3個內含子，分子量約12 kD，是由132個氨基酸組成的非糖基化蛋白。研究表明，IL-13具有促進B細胞分化、提高B細胞活性、減少B細胞凋亡和誘導B細胞合成過多的IgE等從而增加哮喘發生的危險性。Zhu等［12］通過轉基因技術發現，IL-13轉基因陽性小鼠可出現顯著的氣道炎癥、氣道阻塞及氣道高反應性現象，提示IL-13可獨立參與哮喘的病理生理過程，是哮喘的一個重要的誘發因素。

近年來，隨著分子生物學的發展，從基因水平上去認識、診斷和治療疾病越來越受到人們的重視。多項研究表明，IL-13基因內含子區+1923C/T多態性與支氣管哮喘的發生密切相關。2010年華西醫科大學呼吸疾病研究所的一項薈萃分析發現，7個基因多態性與哮喘的發病密切相關，其中IL-13+1923C/T、2044A/G基因多態性是中國成人哮喘發病的獨立危險因素［13］。侍杏華等［5～7］研究發現，IL-13+1923位點T等位基因可能是哮喘的易感基因。

本研究結果顯示，哮喘患者IL-13基因內含子區+1923位點存在C/T突變，且該基因型符合遺傳平衡，具有群體代表性。哮喘組TT型和T等位基因頻率明顯高于對照組，且T等位基因攜帶者(TT+CT型)在哮喘組明顯高于對照組。與CC純合子相比，TT+CT基因型者哮喘患病風險明顯高于對照組，說明T等位基因與哮喘的發病相關。近年認為，IL-13基因內含子區+1923 C/T突變導致IL-13 mRNA的表達增多進而影響血清IL-13及總IgE的水平，進一步導致哮喘的發病。其可能機制［14］為:①當IL-13+1923位點為胞嘧啶時，甲基化DNA可直接干擾轉錄因子與其結合，阻礙轉錄進行，而當發生C/T突變時，這種干擾作用消失，轉錄速度將加快，IL-13 mRNA表達量將增加。②5-甲基胞嘧啶能與特異性甲基化DNA蛋白結合，從而阻斷或取代轉錄因子的作用，轉錄速度下降;如果5-甲基胞嘧啶脫氨基形成胸腺嘧啶時，則這種阻斷作用消失，因而轉錄速度將加快。③內含子是高等真核生物基因中主要的非編碼元件，以往曾被認為無重要功能，但近年研究表明，它在RNA剪切過程中可能有重要作用。RNA剪切過程就是精確去除內含子，而內含子堿基發生位點突變后，可能造成內含子剪切異常，并可能導致基因重組、外顯子重復或者外顯子再現而提高了特異功能結構域的劑量，從而提高蛋白質的活性或使翻譯后剪切產生多個功能單位而引起劑量效應。當然IL-13+1923位點基因多態性對轉錄及翻譯水平影響的確切機制尚未完全明了，這有待國內外專家在基因分子水平上深入研究。

另外，本研究還發現，觀察組IL-13基因內含子區+1923位點等位基因 C、T的頻率分別為63.33%、36.67%;而196例英國高加索人該位點等位基因頻率分別為82.4%、17.6%［15］。這說明不同國家、民族的人群單核苷酸多態性頻率分布因不同人群之間的遺傳距離以及各族群不同的地理環境和生活方式對基因的選擇作用不同而不同，這為人種學及人類遷徙的研究提供更多的科學依據。

綜上所述，IL-13基因內含子區+1923C/T多態性在支氣管哮喘發病過程中起重要作用，T等位基因可能是促進哮喘發病的一個危險遺傳因素。然而，支氣管哮喘是一種多因素、多基因遺傳性疾病，單一致病基因的影響可能對疾病的發生僅產生微效作用。同時，由于人群的種族、地區差異以及實驗條件的局限性，IL-13 T等位基因與支氣管哮喘發病的確切關系以及能否作為哮喘發病的分子遺傳學標志，還有待大樣本的病例對照研究、前瞻性研究以及IL-13基因在細胞內的分子生物學水平研究進一步加以驗證。

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