阿利吉侖對(duì)阿霉素腎病小鼠腎臟的保護(hù)作用

伍巧源，廖蘊(yùn)華，楊楨華，郭 誼，周穎川

(1廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧530021;2廣西醫(yī)科大學(xué)研究生院)

腎素—血管緊張素系統(tǒng)(RAS)過(guò)度激活是腎臟疾病發(fā)生、發(fā)展的重要機(jī)制之一，故抑制RAS是治療腎臟病的有效途徑。但20%～40%腎臟病患者應(yīng)用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)或血管緊張素受體阻斷劑(ARB)抑制RAS后蛋白尿仍持續(xù)存在，并可能導(dǎo)致血管緊張素(AngⅡ)水平增高，出現(xiàn)醛固酮逃逸。阿利吉侖是新型腎素抑制劑，可阻斷RAS的初始步驟，使AngⅠ、AngⅡ水平明顯降低，能更徹底地阻斷RAS。有研究表明，阿利吉侖有延緩糖尿病腎病腎損害進(jìn)展的作用。但在原發(fā)腎臟疾病中，阿利吉侖能否發(fā)揮良好的防治作用，相關(guān)報(bào)道較少。為此，本研究觀察了阿利吉侖對(duì)阿霉素腎病小鼠腎臟的保護(hù)作用，以探尋其對(duì)原發(fā)慢性腎臟病的治療價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料 8周齡、雄性BALB/c小鼠30只，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。采用抽簽法隨機(jī)均分為5組:正常對(duì)照組、阿霉素腎病組、阿利吉侖組、纈沙坦組及阿利吉侖+纈沙坦組。注射用鹽酸阿霉素:浙江海正藥業(yè)股份有限公司;阿利吉侖及纈沙坦:瑞士諾華制藥有限公司。

1.2 方法

1.2.1 阿霉素腎病小鼠模型的建立、分組及處理除正常對(duì)照組外，各組均一次性尾靜脈注射阿霉素(10 mg/kg)建立阿霉素腎病模型。其中，阿利吉侖組給予阿利吉侖3 mg/(kg·d);纈沙坦組給予纈沙坦5 mg/(kg·d)，阿利吉侖+纈沙坦組分別給予單用劑量。正常對(duì)照組給予一次性尾靜脈注射等量生理鹽水。成模標(biāo)準(zhǔn)為注射阿霉素6周后，小鼠出現(xiàn)明顯蛋白尿、低蛋白血癥等特征性改變及出現(xiàn)進(jìn)展性腎小球硬化和腎小管間質(zhì)損害。

1.2.2 血生化指標(biāo)檢測(cè) 各組研究開(kāi)始后第2、6周行24 h尿蛋白定量、尿蛋白/肌酐測(cè)定。在阿霉素注射后第6周處死小鼠。處死前心臟穿刺取血標(biāo)本，用鄰苯三酚紅比色法檢測(cè)24 h尿蛋白定量，全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清肌酐、白蛋白和膽固醇。

1.2.3 腎臟組織病理學(xué)觀察 處死小鼠后，取部分腎組織以10%甲醛固定，石蠟包埋。腎組織石蠟切片行PAS、HE和Masson染色，觀察腎組織腎小球硬化程度和腎小管損害程度。腎小球硬化程度按0～4分的半定量計(jì)分法評(píng)價(jià):無(wú)硬化改變，為0分;硬化占整個(gè)腎小球面積的25%以下，為1分;占整個(gè)腎小球面積的26%～50%，為2分;占整個(gè)腎小球面積的51%～75%，為3分;占整個(gè)腎小球面積的76%～100%，為4分。每只小鼠至少評(píng)價(jià)30個(gè)腎小球，腎小球硬化的最終評(píng)分由所評(píng)價(jià)小鼠所有腎小球計(jì)分的平均值得出。評(píng)分采用盲法。腎小管間質(zhì)的損傷定義為近端小管刷狀緣消失、腎小管擴(kuò)張、萎縮以及間質(zhì)纖維化形成，按程度以0～4分的半定量計(jì)分方法評(píng)價(jià):正常，為0分;小管間質(zhì)損害＜25%，為1分;小管間質(zhì)損害25%～50%，為2分;小管間質(zhì)損害51%～75%，為3分;小管間質(zhì)損害＞75%，為4分。每只小鼠至少評(píng)價(jià)30個(gè)連續(xù)非重疊的皮質(zhì)區(qū)高倍鏡下視野(×400)，最終評(píng)分由所有高倍鏡下視野計(jì)分的平均值得出，評(píng)分采用盲法。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，結(jié)果比較采用方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組血生化指標(biāo)比較 見(jiàn)表1。

表1 各組血生化指標(biāo)結(jié)果比較(±s)

表1 各組血生化指標(biāo)結(jié)果比較(±s)

注:與正常對(duì)照組比較，☆P＜0.05;與阿霉素腎病組比較，*P＜0.05

組別 n 24小時(shí)尿蛋白(mg)2周 6周肌酐2周 6周尿蛋白/白蛋白(g/L)膽固醇(mmol/L)肌酐(μmol/L)正常對(duì)照組 6 0.58 ±0.13 0.58 ±0.13 0.17 ±0.03 0.15 ±0.05 50.90 ±4.58 2.91 ±0.32 37.58 ±1.18阿霉素腎病組 6 2.97 ±0.88☆ 2.38 ±0.25☆ 1.09 ±0.21☆ 0.73 ±0.03☆ 32.48 ±5.43☆ 5.10 ±0.29☆ 61.61 ±3.45☆阿利吉侖組 6 2.36 ±0.39 1.25 ±0.29* 0.68 ±0.17 0.31 ±0.12* 42.12 ±5.02* 4.63 ±0.25* 50.27 ±2.76*纈沙坦組 6 2.45 ±0.55 1.46 ±0.37* 0.75 ±0.18 0.35 ±0.14* 40.75 ±6.32* 4.51 ±0.32* 51.27 ±3.26*阿利吉侖 + 纈沙坦組 6 2.25 ±0.41 1.16 ±0.27* 0.65 ±0.13 0.26 ±0.11* 43.25 ±5.89* 4.73 ±0.72 46.27 ±4.06*

2.2 各組腎臟組織病理?yè)p害情況比較 注射阿霉素6周后，與正常對(duì)照組比較，阿霉素腎病組腎臟出現(xiàn)局灶性節(jié)段性腎小球硬化，甚至個(gè)別球性硬化、腎間質(zhì)廣泛纖維化和小管萎縮。相比于阿霉素腎病組，阿利吉侖組、纈沙坦組或阿利吉侖+纈沙坦組腎小球硬化和小管間質(zhì)損害等病變均得到有效改善，其中阿利吉侖組腎小球硬化和小管間質(zhì)損害程度均較纈沙坦組改善明顯，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;而阿利吉侖+纈沙坦組較二者單用小管間質(zhì)的損害顯著改善(P＜0.05)。各組腎小球硬化半定量評(píng)分、腎小管兼職損傷半定量評(píng)分比較見(jiàn)表2。

表2 各組腎臟組織病理?yè)p害情況比較(分，±s)

表2 各組腎臟組織病理?yè)p害情況比較(分，±s)

注:與正常對(duì)照組比較，★P＜0.05;與阿霉素腎病組比較，*P＜0.05;與纈沙坦組比較，※P ＜0.05;與阿利吉侖組比較，▲P ＜0.05

組別 n 腎小球硬化半定量評(píng)分腎小管間質(zhì)損傷半定量評(píng)分正常對(duì)照組6 0.01 ±0.00 0.01 ±0.00阿霉素腎病組 6 0.73 ±0.21★ 1.55 ±0.13★阿利吉侖組 6 0.38 ±0.17* 0.56 ±0.05*纈沙坦組 6 0.42 ±0.18* 0.65 ±0.07*阿利吉侖 ± 纈沙坦組 6 0.31 ±0.22* 0.32 ±0.04＊※▲

3 討論

慢性腎臟疾病(CKD)的主要組織學(xué)特點(diǎn)包括腎小球硬化、小管間質(zhì)纖維化、腎小管萎縮等［1］，這些病理改變都與RAS各組分之間有著重要關(guān)系。AngⅡ是RAS的主要活性肽，AngⅡ可通過(guò)壓力依賴性途徑及非壓力依賴性途徑使腎臟出現(xiàn)蛋白尿、細(xì)胞外間質(zhì)增多、膠原沉積等變化，最終出現(xiàn)腎小球硬化、腎間質(zhì)纖維化［2］。抑制RAS各個(gè)環(huán)節(jié)均為腎臟病治療的有效途徑，故ACEI或ARB類藥物能延緩慢性腎臟病的進(jìn)展［3，4］。盡管ACEI或ARB類藥物能很大程度上延緩慢性腎臟病的進(jìn)展，但該類藥物仍有其不足之處:①ACEI或ARB可導(dǎo)致醛固酮逃逸。已有研究證實(shí)，醛固酮參與腎臟損傷，醛固酮逃逸者GFR下降率快于無(wú)逃逸者［5］。②長(zhǎng)期應(yīng)用ACEI，可導(dǎo)致AngⅠ堆積，使旁路激活，循環(huán)及組織中AngⅡ濃度逐漸回升到治療前水平，出現(xiàn)所謂的“AngⅡ逃逸”現(xiàn)象。③ARB高度特異性地拮抗血管緊張素1型受體(AT1)，阻斷了AngⅡ絕大多數(shù)的生物學(xué)功能，但長(zhǎng)期應(yīng)用可導(dǎo)致AngⅠ、AngⅡ升高，血管緊張素2型受體(AT2)等過(guò)度激活，導(dǎo)致心臟肥大或血管纖維化等不良后果。

相比于ACEI或ARB類藥物，腎素抑制劑阻斷RAS的初始步驟是使AngⅠ、AngⅡ水平明顯減低，更徹底地抑制RAS系統(tǒng)，減少醛固酮逃逸現(xiàn)象。阿利吉侖是一種非肽類腎素抑制劑，具有吸收快、水溶性好、生物利用度高和半衰期長(zhǎng)等特點(diǎn)［16］。目前關(guān)于該藥的研究主要集中于糖尿病繼發(fā)腎損害。研究發(fā)現(xiàn)，阿利吉侖可減少糖尿病腎病小鼠蛋白尿，延緩腎小球硬化進(jìn)展，而且其抑制間質(zhì)纖維化的作用要強(qiáng)于 ACEI［7］。Parving 等［8］研究發(fā)現(xiàn)，阿利吉侖聯(lián)合絡(luò)沙坦可使糖尿病腎病患者尿白蛋白/肌酐下降20%，其中24.7%患者該指標(biāo)下降50%。另一研究也證實(shí)，阿利吉侖與ARB聯(lián)合應(yīng)用對(duì)糖尿病腎損害有協(xié)同保護(hù)作用［9］。

小鼠阿霉素腎病模型類似于人類的局灶性節(jié)段性腎小球硬化，其病理特征為進(jìn)展性的腎小球硬化、小管間質(zhì)損害等［10］，是研究人類腎小球疾病的重要模型之一。本研究中，所有注射阿霉素的小鼠均出現(xiàn)以蛋白尿、低蛋白血癥、高脂血癥和腎功能損害為特征的阿霉素腎病，與人類局灶性節(jié)段性腎小球硬化患者腎病綜合征的發(fā)展一致。給予阿霉素腎病小鼠阿利吉侖、纈沙坦及二者聯(lián)合應(yīng)用后，24 h尿蛋白均有顯著改善，血清白蛋白顯著上升，明顯延緩了腎功能惡化。組織學(xué)評(píng)價(jià)顯示，阿利吉侖、纈沙坦及二者聯(lián)合應(yīng)用均可明顯減輕腎小球硬化和腎小管間質(zhì)損害。但二藥單用小鼠尿蛋白減少及腎間質(zhì)纖維化改善程度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由于阿利吉侖可消除ARB致AngⅡ堆積的效應(yīng)，二者具有聯(lián)合應(yīng)用的理論基礎(chǔ)。已有臨床試驗(yàn)證實(shí)，二者聯(lián)合應(yīng)用對(duì)RAS 的抑制有協(xié)同作用［11，12］;新近有報(bào)道，慢性腎臟病患者給予ARB聯(lián)合阿利吉侖較ARB聯(lián)合苯那普利有更好的降尿白蛋白效果［13］。本研究發(fā)現(xiàn)，相比于二藥單用，聯(lián)合用藥后阿霉素腎病小鼠尿蛋白有下降趨勢(shì)，但是差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而小管間質(zhì)的損害較二者單用顯著改善，提示二者聯(lián)合應(yīng)用對(duì)腎臟病理?yè)p害有協(xié)同保護(hù)效應(yīng)。

綜上所述，阿利吉侖對(duì)阿霉素腎病小鼠有良好的腎臟保護(hù)作用，與ARB類藥物聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同保護(hù)作用。

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