兩種方法對蒙藥金訶子低溫提取物多糖成分和含量測定結果比較

羅 夏，宣成睿，趙小霞，趙鵬偉，孫 鵬，楊麗敏

(1內蒙古醫科大學，呼和浩特010059;2天津市第四中心醫院)

現代藥理學研究發現，訶子提取物中含有多種糖類，如阿拉伯糖、果糖、葡萄糖等，且這些糖類為其重要活性成分［1～3］。目前，指紋圖譜被認為是能夠較全面地反映藥材提取物質量變化的質控技術，紅外光譜因其專屬性強、重現性好、操作方便等優勢已成為中藥研究化學圖譜不可缺少的工具，其在中草藥及中成藥有效成分含量的測定中具有獨特作用［4，5］。本研究選定紅外光譜技術描繪蒙藥金訶子不同部位的指紋圖譜，同時通過硫酸—蒽酮比色法測定其5個部位中多糖的成分和含量，比較兩種方法在多糖測定中的優缺點。

1 材料與方法

1.1 材料 蒙藥金訶子購于內蒙古呼和浩特市中蒙醫院;葡萄糖、蒽酮、濃硫酸等試劑購于北京化學試劑二廠。主要儀器:GZX-9070MBE電熱恒溫鼓風干燥箱、LGJ-18冷凍干燥機、UV-2401PC紫外分光光度計、UV-9200紫外分光光度計、DZG-303A離子純水機、MK-08隔水式電熱恒溫培養箱、HHS恒溫水浴鍋。

1.2 方法

1.2.1 金訶子不同部位提取物的制備 取蒙藥金訶子1 000 g，粉碎后為990 g，加入5 000 mL的超純水，浸泡5 h，放入-25℃的冰箱冷凍，過夜。將冷凍后的金訶子解凍，4 000 r/min離心40 min，去渣，留上清液。上述方法重復兩次，將兩次獲得的上清液混合，用不同的分離方法及透析膜分離技術分離出5個有效部位(1號部位為水提離心上清部位，2號部位為水提離心沉淀部位，3號部位為通過5萬分子膜膜內部位，4號部位為醇提水解部位，5號部位為通過5萬分子膜膜外部位)，將不同部位的提取液冷凍干燥，即得5個部位的提取物干粉。

1.2.2 紅外光譜技術檢測金訶子提取物中多糖成分和含量 將5個部位的提取物在清華大學分析中心采用紅外光譜技術進行成分和含量測定。

1.2.3 硫酸—蒽酮比色法檢測金訶子提取物多糖成分和含量 ①硫酸蒽酮溶液的配制:稱取蒽酮0.2 mg，加100 mL濃硫酸溶解。②對照品溶液的配制:稱取70℃干燥至恒重的無水葡萄糖對照品0.200 3 g，置100 mL容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，然后取其10 mL，置于另一100 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得0.2 mg/mL的對照品溶液。③樣品溶液的配制:分別稱取金訶子的5個不同部位提取物的干燥樣品粉末各100 mg，分別置于5個100 mL的容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。取上述5份溶液各10 mL分別置于100 mL的容量瓶中，分別加蒸餾水稀釋至刻度，再次搖勻，得5個金訶子不同部位提取物的0.1 mg/mL的樣品稀釋液。④測定條件的選擇:分別取1 mL葡萄糖標準對照品溶液和金訶子多糖樣品溶液于50 mL具塞試管中，加蒸餾水稀釋至刻度，再加入8 mL蒽酮溶液，搖勻。浸于冰水浴中冷卻后，移至沸水浴中加熱10 min，取出后置于冰水浴中10 min，然后倒入比色皿中，用紫外分光光度計分別在450～700 nm范圍下進行掃描。⑤標準曲線的制備:取葡萄糖對照品溶液 0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0 mL，分別置于50 mL具塞試管中，各用蒸餾水補至2 mL作為5份供試品溶液。另取一空白具塞試管放入蒸餾水2 mL，與供試品管作以下同步處理，各管分別加入蒽酮試液8 mL，搖勻，浸于冰水浴中冷卻，然后移至沸水浴中加熱10 min，取出后置于冰水浴中放置10 min，在574 nm的波長處測定吸光度，平行測定3份。以吸光度為橫坐標，濃度為縱坐標，繪制標準曲線。⑥精密度試驗:取5份對照品1 mL(濃度0.2 mg/mL)，按標準曲線的制備方法操作，測定吸光度，計算RSD值。⑦穩定性試驗:以1號部位為代表，取樣品2 mL(濃度0.1 mg/mL)，按樣品測定的方法操作，于室溫自然光下放置，每20 min測定1次吸光度，共檢測8次，觀察其穩定性。⑧重復性試驗:以1號部位為代表，取樣品2 mL(濃度0.1 mg/mL)，按樣品測定的方法操作，測定吸光度，計算RSD值。⑨加樣回收率測定:以1號部位為代表，取樣品2 mL(濃度0.1 mg/mL)置于50 mL具塞試管中，按樣品測定的方法測定其吸光度，并換算出金訶子多糖含量。再加入0.04 mg無水葡萄糖作對照，再次測定其吸光度，并換算出金訶子多糖含量，平行測定6次，計算加標回收率和RSD值。⑩蒙藥金訶子不同提取物多糖含量的測定:取5份樣品稀釋液各2 mL置于5個50 mL具塞試管中，另取一空白具塞試管放入蒸餾水2 mL，與各樣品管作以下同步處理。各管分別加入蒽酮試液8 mL，搖勻，浸于冰水浴中冷卻，移至沸水浴中加熱10 min，取出后置于冰水浴中放置10 min，以空白管為對照，在574 nm波長處測定各吸光度。每份樣品平行測2次。

1.2.4 統計學方法 采用 SPSS10.0統計軟件，計量資料以±s表示，比較采用t檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 5個部位提取物多糖成分和含量比較 1號部位在1 169.89/cm、1 207.53/cm 附近有峰圖，2 號部位在1 173.42/cm、1 027.26/cm 附近有峰圖，3 號部位在1 166.73/cm、1 025.95/cm 附近有峰圖，4 號部位在1 166.01/cm、1 025.72/cm 附近有峰圖，5 號部位在1 196.02/cm、1 027.07/cm 附近有峰圖，而紅外光譜技術圖譜中1 170/cm、1 028/cm附近的吸收峰為C-O的伸縮振動，說明樣品中含有多糖類物質［6］，提示5個部位提取物均含有多糖成分，但不同部位多糖含量比較P＞0.05。

2.2 硫酸—蒽酮比色法波長的選擇和標準曲線的制備 葡萄糖的紫外線最大吸收波長在580 nm處，而金訶子多糖的紫外線最大吸收波長在570 nm處，兩者形狀及葡萄糖吸收曲線基本一致，且最大吸收波長相差不大，說明用葡萄糖做標準品是可靠的［7］。故在實驗中選擇574 nm作為測定波長。其不同濃度葡萄糖570 nm波長下的線性回歸方程為Y=0.205 1X-0.003 4，R=0.999 1(Y 代表多糖含量，X代表OD值，R代表判定系數)，其標準曲線見圖1。其標準曲線表明，每毫升樣品中含40～200 μg葡萄糖時與其吸光度呈良好的線性關系。

圖1 574 nm波長下不同濃度葡萄糖吸光度標準曲線

2.3 硫酸—蒽酮比色法的精密度、穩定性、重復性、加標回收率 精密度:5份對照品RSD為0.460%(n=5);穩定性:以蒙藥金訶子1號部位為代表，金訶子多糖含量在2 h內無統計學差異;重復性:以蒙藥金訶子1號部位為代表，其RSD=1.616%(n=5);同樣以蒙藥金訶子1號部位為代表，其加標回收率為(110.13±0.010)%，RSD=0.946%。

2.4 5個部位提取物硫酸—蒽酮比色法多糖含量檢測結果比較 1號部位多糖含量為(20.40±0.18)%，2 號部位為(19.45 ±0.20)%，3 號部位為(14.15 ±0.07)%，4 號部位為(22.15 ±0.12)%，5號部位為(17.40±0.05)%。多糖含量最少的3號部位與1號和2號部位比較差異均有統計學意義(P 均 ＜0.05)。

3 討論

訶子為君子科植物訶子及其變種絨毛訶子干燥的成熟果實，曬干后入藥，其味澀性平，可祛三弊所引起的諸疾，有解毒之功效，被譽為“蒙藥之王”［8，9］，而金訶子是蒙藥訶子當中的最佳品種，其狀如葫蘆尾，果實中部呈卵形，里面有核，色如葫蘆黃而有紅色光澤，具有澀腸止瀉、利咽、調和藥性、解毒等功效。

中藥炮制工藝能有效降低或消除藥物毒副作用，改變藥物的性狀、性能或功效，對促進臨床用藥效果、安全性具有重要作用［9］。目前HPLC指紋圖譜技術可以作為訶子工藝篩選過程中的有效評價手段［6］，但是HPLC主要采用液相檢測的方法，將藥材溶于水或醇相進行檢測，而紅外光譜技術無需對樣品預處理，反映藥材真實的整體信息，可用于中藥的定性和定量測定［7，10］。故本研究采用紅外光譜技術和硫酸—蒽酮比色法檢測蒙藥金訶子中多糖成分和含量的差異，進而對檢測方法進行優選。

本研究結果表明，兩種方法均檢測到了多糖成分。紅外光譜技術檢測結果表明，5個不同部位提取物在1 170/cm、1 028/cm附近均有吸收峰，此吸收峰為C-O的伸縮振動，說明樣品中含有多糖類物質，5個部位之間多糖含量比較差異無統計學意義;而硫酸—蒽酮比色法檢測結果顯示，多糖含量在5個部位之間有顯著性差異。這可能是因為紅外光譜技術的定量分析不僅需要利用紅外光譜信息，還需要依據標準方法，如藥典規定的HPLC方法獲得參考值建立模型。由于紅外光譜技術測量的樣品一般是微量的，而標準方法無法對微量樣品進行分析，故目前紅外技術很少應用于定量分析;但隨著現代分析方法的進步，標準方法測量微量樣品的精度將逐步提高，因此紅外光譜技術發展的另一個趨勢是微量分析［11］。

綜上所述，我們認為可選擇紅外光譜技術對蒙藥金河子低溫提取物進行成分分析，同時分析其與原藥材的成分差異，具體到含量測定可以選擇《中國藥典》中相應的方法進行檢測。

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