腦膠質瘤中miR?143對MACC1表達的調控作用

尚超，洪楊，郭艷，薛一雪

（中國醫科大學1.基礎醫學院神經生物教研室，沈陽 110001；2.附屬盛京醫院神經外科，沈陽 110004；3.附屬口腔醫院中心實驗室，沈陽110002）

腦膠質瘤是最常見的顱內腫瘤，約占中樞神經系統腫瘤的60%，具有惡性程度高、侵襲能力強等特性［1］。腦膠質瘤患者即使經手術及術后放化療等治療手段的積極干預，死亡率仍高達98%以上，2年生存率僅為20%。因此，加強對腦膠質瘤的病因學研究尤為迫切［2］。

本研究組的前期研究發現，MACC1基因在腦膠質瘤組織中表達明顯上調，是腦膠質瘤潛在的癌基因［2］。但MACC1表達上調的原因尚不清楚。本研究擬應用實時定量PCR檢測miR?143和MACC1基因在腦膠質瘤中的表達，并研究miR?143在腦膠質瘤中對MACC1表達的調控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象：37例腦膠質瘤及相應的癌旁組織均來源于2011年4月15日至2012年11月7日期間中國醫科大學附屬盛京醫院神經外科住院患者。男22例，女15例，年齡45～62歲，中位年齡56.2歲。

人腦膠質瘤U87細胞系由中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫提供。

1.1.2 主要試劑：miRNA分離試劑盒及miRNA檢測試劑盒 All?in?OneTMmiRNA qRT?PCR Detection Kit購自Genecopoeia公司。pre?miR?143、anti?miR?143及control miRNA購自Ambion公司。轉染試劑Transmessenger購自Qiagen公司。引物由上海生工公司合成。抗MACC1抗體購自Abcam公司。West?ern blot相關試劑購自上海碧云天公司。熒光素酶活性檢測系統Dual?Luciferase Reporter System購自Promega公司。野生型MACC1 3′非翻譯區（3′un?translation region，3′UTR）熒光素酶載體 pGL3?MACC1 3′UTR?Wt（Wt.UTR）及突變型MACC1 3′UTR熒光素酶載體pGL3?MACC1 3′UTR?Mut（Mut.UTR）由Invitrogen公司提供。

1.2 方法

1.2.1 miR?143表達的檢測：待測組織標本經液氮冷凍粉碎，應用mirVanaTMmiRNA isolation試劑盒提取總microRNA，應用All?in?OneTMmiRNA qRT?PCR Detection Kit對獲取的microRNA的3′端進行加“Poly A”處理，然后將Poly A化的RNA進行反轉錄反應。以U6為內參基因，參照試劑盒說明書擴增miR?143基因。應用ABI公司的7500 Real?time PCR儀，7500 Software v2.0軟件。采用比較CT值法（2-ΔΔCT法）對獲得的數據進行相對定量分析。計算公式：（1）改變的倍數＝2-ΔΔCT；（2）ΔΔCT＝ΔCT腫瘤組-ΔCT癌旁組；（3）ΔCT＝CT靶基因-CT內參。

1.2.2 細胞轉染：將U87細胞接種在6孔板中（5×104個/孔），培養24 h。1 mg的microRNA與試劑盒中的Enhanser R試劑混合，再與4 μL TransMessenger試劑混合，獲得的混合物加入900 μL無血清培養基后用于孵育待轉染的U87細胞，2 h后吸去培養基，PBS清洗2次，然后用正常培養基培養。

1.2.3 實驗分組：以未轉染的U87細胞為空白對照組（C1）；以轉染control miRNA的U87細胞為陰性對照組（C2）；以轉染pre?miR?143的U87細胞為pre?miR?143組（pre?miR?143）；以轉染anti?miR?143的U87細胞為anti?miR?143組（anti?miR?143）。

1.2.4 Western blot：提取待測細胞蛋白，Bradford法進行定量。蛋白樣品上樣后，經SDS?PAGE電泳、轉膜、封閉、抗體孵育、ECL發光和成像等步驟后獲得圖像結果。經GDS凝膠成像分析系統進行分析，MACC1的灰度值與內參蛋白GAPDH的灰度值的比值即為MACC1蛋白表達的相對值。

1.2.5 熒光素酶報告基因表達分析：將microRNAs及重組載體共轉染腦膠質瘤U87細胞。分組如下：A組：pre?miR?143+Wt.UTR；B組：miR?143 control+Wt.UTR；C組：pre?miR?143+Mut.UTR；D組：miR?143 control+Mut.UTR。應用雙熒光素酶檢測系統（Dual?LueiferaseReporterSystem）檢測轉染后的細胞熒光素酶活性，步驟如下：棄培養液，PBS漂洗2次；加入1×PLB裂解液20 μL，常溫振蕩裂解15 min；加入LARⅡ溶液100 μL，雙報告系統熒光素酶檢測儀讀取熒光值；加入Stop溶液100 μL，再次讀取熒光值；計算相對熒光值。計算公式：相對熒光值=螢火蟲熒光素酶熒光值/海腎熒光素酶熒光值。

1.3 統計學分析

每組實驗重復3次。應用SPSS18.0統計軟件對數據進行統計學處理。所有實驗數據經正態性檢驗以明確資料的總體分布類型，正態分布數據用±s表示。樣本呈正態分布且方差齊的多組間差異比較應用單因素方差分析，再用LSD?t檢驗做兩兩比較。2組獨立樣本均值比較采用t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 實時定量PCR檢測腦膠質瘤組織中miR?143和MACC1的表達

通過引物溶解曲線分析，miR?143和MACC1基因均擴增成功。實時定量PCR結果經比較CT值法分析進行相對定量，miR?143在腦膠質瘤和癌旁組織中的ΔCT分別為6.043±0.427與5.216±0.418，ΔΔCT為0.827，腦膠質瘤組織中miR?143的表達明顯下調，為癌旁組織中miR?143表達量的56.37%，差異有統計學意義（P＆lt;0.01）。

MACC1 mRNA在腦膠質瘤組織和癌旁組織中的ΔCT分別為 3.438±0.415與 4.834±0.463，ΔΔCT為-1.396，腦膠質瘤組織中MACC1 mRNA的表達明顯上調，為癌旁組織中MACC1 mRNA表達量的263.17%，差異有統計學意義（P＆lt;0.01）。

2.2 miR?143和MACC1表達的相關性分析

對實時定量PCR獲取的miR?143和MACC1表達的數據進行Pearson相關分析，2者表達的相關系數為-0.792，證實miR?143和MACC1的表達在腦膠質瘤中呈顯著的負相關。

2.3 pre miR?143和 anti?miR?143對 U87細胞中MACC1蛋白表達的影響

Western blot結果顯示：C1組、C2組、pre?miR?143組和anti?miR?143組均呈現清晰條帶（圖1）。4組細胞中MACC1蛋白的相對表達量分別為1.364±0.079、1.348±0.076、0.683±0.065和2.146±0.087。C1組和C2組之間無統計學差異；與對照組相比，pre?miR?143組中MACC1蛋白表達顯著降低，而anti?miR?143組中MACC1蛋白表達顯著增加，差異有統計學意義（P＆lt;0.05）。

圖1 pre?miR?143和anti?miR?143對U 87細胞中M A C C 1蛋白表達的影響Fig.1 Influenceofpre?miR ?143 andanti?miR ?143 ontheexpressionofM A C C 1 proteininU 87 cells

2.4 熒光素酶報告基因表達分析

應用共轉染技術將不同組合的pre?miR?143、miR?143 control、野生型表達載體Wt.UTR和突變型表達載體Mut.UTR轉染到U87細胞中，結果表明共轉染pre miR?143和Wt.UTR的報告基因活性相對于其他對照組明顯降低，差異有統計學意義（P＆lt;0.05）（圖2）。

圖2 熒光素酶報告基因表達分析驗證miR?143對M A C C 1基因的調控Fig.2 R egulatoryeffectofmiR?143 onM A C C 1 geneasverified byluciferasereportergeneexpressionanalysis

3 討論

本研究組在前期研究中發現：腦膠質瘤組織中MACC1基因表達顯著上調，而且應用RNA干擾技術沉默了U87細胞中MACC1基因后，結果顯示MACC1基因沉默的U87細胞的增殖活力降低，凋亡率顯著增強［2］。提示MACC1基因在腦膠質瘤中可能作為癌基因存在，但MACC1表達上調的原因尚不清楚。

microRNAs（miRNAs）是一類非編碼的小分子RNA，長度為19～25個核苷酸。miRNAs主要通過與靶基因mRNA 3′UTR的完全或不完全配對，引起mRNA降解或翻譯抑制，從而在轉錄后水平調控基因的表達［3］。miRNAs能夠通過調節下游基因的表達和功能從而參與調控個體發育、細胞凋亡、增殖及分化等生命活動［4，5］。我們應用 miRBase等生物信息學軟件預測miR?143能夠與MACC1基因的3′UTR結合。miR?143基因定位于5q32，在乳腺癌和腎癌等惡性腫瘤中呈現顯著的表達降低［6～8］，而且能夠通過靶向抑制CD44v3的表達進而抑制非小細胞肺癌的侵襲和轉移［9］，在多種腫瘤中發揮腫瘤抑制基因的作用。據此我們推測，miR?143可能與MACC1基因存在調控關系，它在腦膠質瘤中的表達改變可能是MACC1基因表達上調的原因。

本研究中，實時定量PCR檢測結果發現miR?143在腦膠質瘤組織中表達明顯下調，相關性分析顯示miR?143與MACC1基因的表達水平呈明顯負相關。這與我們前期的預測相符。將pre?miR?143和anti?miR?143分別轉染U87細胞，結果發現pre?miR?143和anti?miR?143能夠分別下調和上調U87細胞中MACC1蛋白的表達。進一步證實了miR?143能夠調控MACC1，抑制其表達，但MACC1是否為miR?143的靶基因，miR?143是否是通過直接與MACC1基因的3′UTR結合進而抑制其表達尚不清楚。熒光素酶報告基因檢測分析明確了miR?143能夠與MACC1基因3′UTR的結合，對MACC1基因的表達起負性調控作用。近期已有文獻報道，miR?143能夠在結直腸癌細胞中靶向負性調節MACC1基因的表達，其抑制效果及與MACC1基因的3′UTR的結合位點都與本研究結果相同，這證實了在多種腫瘤中miR?143對MACC1基因具有相同的調控作用［10］。

綜上所述，本研究結果顯示miR?143在腦膠質瘤中表達下調，且miR?143能夠與MACC1基因的3′UTR結合，負性調控MACC1基因的表達，miR?143的表達下調是MACC1基因在腦膠質瘤中表達上調的原因之一。

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