肝缺血/再灌注損傷對(duì)血漿及下丘腦orexin-A表達(dá)的影響

趙 琳，賈鯤鵬，王 璐，劉伯鋒，魏曉麗(延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院解剖教研室，延安 76000;延安大學(xué)附屬醫(yī)院兒科;通訊作者，E-mail:jkpzhaolin@63.com)

肝缺血/再灌注 (hepatic ischemia/reperfusion，H-I/R)損傷常見(jiàn)于肝切除、肝移植、休克后復(fù)蘇等，在損傷過(guò)程中機(jī)體常出現(xiàn)嚴(yán)重的能量代謝障礙和炎癥反應(yīng)。增食欲素-A(orexin-A)是由下丘腦外側(cè)區(qū)(lateral hypothalamus area，LHA)合成和分泌的具有神經(jīng)興奮作用的多肽，具有刺激攝食和減少能量消耗的作用。orexin-A參與調(diào)控睡眠/覺(jué)醒、下丘腦-垂體-甲狀腺/腎上腺/性腺軸的激素分泌，并刺激兒茶酚胺合成，并與血清葡萄糖、糖皮質(zhì)激素、交感神經(jīng)興奮性存在一定的聯(lián)系［1，2］，提示 orexin-A可能參與了創(chuàng)傷應(yīng)激后內(nèi)環(huán)境紊亂的調(diào)控過(guò)程，是與創(chuàng)傷應(yīng)激密切相關(guān)的代謝因子。我們采用放射免疫法檢測(cè)H-I/R損傷后血漿和下丘腦中orexin-A的水平，并采用RT-PCR方法檢測(cè)下丘腦orexin-A mRNA的表達(dá)，探討H-I/R損傷后orexin-A的表達(dá)變化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組

成年雄性SD大鼠40只，由延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體質(zhì)量250-300 g，隨機(jī)分為5組，分別為假手術(shù)組(sham)、肝缺血1 h后再灌注1 h組(I/R1 h)、肝缺血1 h后再灌注2.5 h組(I/R 2.5 h)、肝缺血1 h后再灌注4 h組(I/R4 h)和肝缺血1 h后再灌注6 h組(I/R6 h)，每組8只。

1.2 動(dòng)物模型制備

2%異戊巴比妥鈉(40mg/kg)腹腔注射麻醉，開(kāi)腹，從右側(cè)肋緣下做斜切口，充分顯露第一肝門(mén)，用微血管夾橫向夾閉支配肝中葉、左葉的肝蒂左分叉，不阻斷支配肝右葉血流的肝蒂右分叉，以防門(mén)靜脈和胃腸道淤血，阻斷血流1 h后取出血管夾進(jìn)行再灌注，腹腔內(nèi)注射1 ml生理鹽水后逐層關(guān)腹。sham組只鈍性游離肝蒂左分叉，不進(jìn)行鉗夾肝蒂操作。

1.3 血漿及下丘腦組織樣品制備

損傷后相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)大鼠心臟取血，加入乙二胺四乙酸(EDTA)和抑肽酶，37℃水浴20 min，3 000×g低溫離心20 min，-20℃保存。抽血后立即取出大鼠下丘腦，置液氮速凍后于-80℃保存。稱(chēng)取下丘腦組織200 mg勻漿，加入1 ml預(yù)冷生理鹽水，20 000 r/min、30 s冰浴勻漿3次。將勻漿液12 000×g離心20 min，保存中層清液-20℃待測(cè)。

1.4 放射免疫分析

向離心管中加入orexin-A、0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.4)、Na125I、氯胺 -T 振蕩反應(yīng) 30 s，加偏重亞硫酸鈉20 μg終止反應(yīng)。將終止液緩慢加載于C-25SEP柱上層，磷酸鹽緩沖液淋洗，收集洗脫液4℃保存。將200 μl樣品與orexin-A抗體、125I-肽渦旋混勻，4℃孵育24 h。再加免疫分離劑500 μl室溫反應(yīng)15 min，4℃、3 000×g離心20 min，棄上清，取沉淀用γ計(jì)數(shù)儀測(cè)定。下丘腦的勻漿液樣品用考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定總蛋白，比較1 g勻漿液總蛋白中所含的orexin-A(μg)。

1.5 reverse transcription-PCR(RT-PCR)

orexin-A引物序列:上游 5’-GGACCACTGCACCGAAGA-3’，下游5’-GGTTACCGTTGGCCTGAA-3’，擴(kuò)增片段324 bp。內(nèi)參照 β-actin:上游5’-CACCCTGTGCTGCTCACCGAGGCC-3’，下游5’-CCACACAGATGACTTGCGCTCAGG-3’，擴(kuò)增片段690 bp。上海英駿生物技術(shù)有限公司合成?？俁NA提取及RT-PCR:將-80℃下保存的下丘腦組織取出后，用Trizol法提取總RNA，依照紫外分光光度計(jì)測(cè)純度與濃度，根據(jù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成，取cDNA 3 μl用于PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件:94℃3 min后94℃40 s，54℃1 min，72℃1 min共35個(gè)循環(huán);72℃延伸7 min。用捷達(dá)凝膠成像分析系統(tǒng)掃描擴(kuò)增帶，用orexin-A的擴(kuò)增產(chǎn)物與β-actin擴(kuò)增產(chǎn)物光密度的比值表示orexin mRNA的相對(duì)值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 H-I/R損傷后血漿及下丘腦orexin-A水平

各再灌注組血漿orexin-A水平與損傷后sham組比較均無(wú)顯著差異，再灌注組間兩兩相比，I/R1 h組顯著高于I/R6 h組(P＜0.05)。各再灌注組下丘腦勻漿液orexin-A水平與損傷后sham組比較及再灌注組間兩兩比較，均無(wú)顯著差異(見(jiàn)表1)。

表1 H-I/R損傷后各組血漿及下丘腦orexin-A水平(±s)Table 1 Changes of orexin-A levels in p lasm a and hypothalamus after H-I/R injury(±s)

表1 H-I/R損傷后各組血漿及下丘腦orexin-A水平(±s)Table 1 Changes of orexin-A levels in p lasm a and hypothalamus after H-I/R injury(±s)

與 I/R6 h組比較，*P＜0.05

組別 血漿orexin-A/(ng/L)下丘腦orexin-A/(μg/g總蛋白)sham組338.62 ±40.02 6.05 ±1.76 I/R1 h 組 356.85 ±28.32* 6.78 ±1.95 I/R2.5 h 組 344.28 ±35.38 4.67 ±1.68 I/R4 h 組 321.09 ±29.59 3.96 ±1.12 I/R6 h組315.04 ±40.12 7.08 ±2.03

2.2 H-I/R損傷后下丘腦orexin mRNA表達(dá)

各再灌注組下丘腦orexin-A mRNA的表達(dá)水平與損傷后sham組比較，I/R4 h和I/R6 h組顯著升高(P＜0.05)。再灌注組之間兩兩比較，I/R4 h和I/R6h組顯著高于 I/R1h組(P＜0.05，見(jiàn)圖1)。

圖1 H-I/R損傷后下丘腦orexin mRNA表達(dá)Figure 1 Expression of orexin-A mRNA in hypothalamus after H-I/R injury

3 討論

H-I/R損傷是指肝缺血一段時(shí)間，當(dāng)血流重新恢復(fù)后，細(xì)胞功能代謝障礙及結(jié)構(gòu)破壞反而較缺血時(shí)進(jìn)一步加重，器官功能進(jìn)一步惡化的臨床綜合征。在肝門(mén)阻斷的肝葉切除、肝移植以及休克的復(fù)蘇等過(guò)程中均會(huì)不可避免地遭遇H-I/R損傷。再灌注損傷是致手術(shù)后肝臟功能衰竭的重要原因之一，是外科治療、急救醫(yī)學(xué)經(jīng)常面臨的問(wèn)題，且具有典型的病理生理改變，其損傷機(jī)制主要是活性氧生成、Ca2+超載、Kupffer細(xì)胞激活和白細(xì)胞活化等［3，4］。orexin-A是1998年Sakurai等［5］在實(shí)驗(yàn)室尋求已知的七次跨膜“孤兒”受體的內(nèi)源性配體時(shí)發(fā)現(xiàn)的，為一種33個(gè)氨基酸的多肽，在不同物種之間，其蛋白序列有很大程度的同源性。參與攝食、睡眠與覺(jué)醒、能量代謝和內(nèi)分泌等多種功能的調(diào)節(jié)，還可能參與創(chuàng)傷、炎癥、感染后內(nèi)環(huán)境紊亂的調(diào)控過(guò)程，與創(chuàng)傷應(yīng)激密切相關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，再灌注各組的血漿orexin-A水平與sham組無(wú)顯著變化?？赡苁窃俟嘧⒃缙诘母叽x造成動(dòng)物機(jī)體類(lèi)似饑餓的狀態(tài)，而此狀態(tài)會(huì)通過(guò)神經(jīng)-內(nèi)分泌系統(tǒng)上調(diào)血漿的orexin-A水平［6］;也可能是因?yàn)橹行粤＜?xì)胞釋放自由基破壞了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和活性，抵消了饑餓狀態(tài)使血漿orexin-A上調(diào)的作用。而血漿orexin-A在I/R1 h組顯著高于I/R6 h組，提示肝再灌注早期的能量?jī)?chǔ)備不足，隨著時(shí)間向后推移，高代謝逐漸恢復(fù)、自由基釋放也逐漸降低，血漿orexin-A水平維持平穩(wěn)態(tài)勢(shì)，提示它受到機(jī)體的宏觀調(diào)控。下丘腦是orexin-A的核心分泌器官，其orexin-A的表達(dá)受血漿水平的反饋調(diào)節(jié)，整個(gè)過(guò)程無(wú)顯著變化。下丘腦orexin mRNA的表達(dá)在H-I/R損傷早期受高代謝狀態(tài)影響，orexin mRNA表達(dá)受到抑制，隨著高代謝狀態(tài)逐步恢復(fù)，orexin mRNA表達(dá)受負(fù)反饋影響逐漸回升。提示orexin參與了H-I/R后的能量代謝調(diào)控。

H-I/R損傷后血漿和下丘腦中orexin-A的表達(dá)水平發(fā)生了一定程度變化，說(shuō)明orexin-A參與了創(chuàng)傷應(yīng)激后內(nèi)壞境紊亂的調(diào)控過(guò)程。深入研究以orexin-A為核心的神經(jīng)-內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)在創(chuàng)傷、炎癥、感染時(shí)發(fā)揮效應(yīng)的可能機(jī)制，將有助于為H-I/R損傷找到有效可靠的干預(yù)手段，減少H-I/R損傷的發(fā)生。

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